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基因療法是通過引入遺傳物質（例如治療性蛋白質的表達系統(tǒng)或校正患病細胞中錯誤基因的編輯工具）來治療遺傳疾病的一種療法。該領域的發(fā)展為人們帶來了希望。以前無法治愈的疾病，例如遺傳性疾病、癌癥和自身免疫性疾病的治療。迄今為止，全世界至少進行了943項基因治療的臨床試驗。遞送對于基因治療至關重要。細胞膜對帶負電的核酸設置不可滲透的屏障。而且，遺傳物質在人體內很脆弱，因此必須加以保護才能生效。mRNA和病毒或非病毒質粒DNA通常是基因治療中使用的遺傳物質。例如，腺相關病毒（AAV）載體得到了廣泛使用。然而，AAV載體誘導宿主免疫反應，導致載體快速降解或中和，并嚴重損害了其基因治療的效率。納米結構（如外泌體）的封裝可保護AAV載體免受宿主免疫系統(tǒng)的侵害，并通過質膜將其遞送到細胞中。香港中文大學夏江教授等在Nanoscale雜志發(fā)表綜述，描述了外泌體作為載體進行封裝和將基因載體遞送至細胞的過程以及相關的疾病治療方法（圖1）。外泌體作為各種遺傳物質的載體的利弊，工程化外泌體以增加負載和遞送的策略，最大化基因負載外泌體產(chǎn)量的方法，以及對外泌體介導的靶向基因治療的未來展望討論。 
根據(jù)來源，基因遞送載體可分為病毒系統(tǒng)或非病毒系統(tǒng)（圖2）。病毒介導的基因遞送系統(tǒng)使用復制缺陷的修飾病毒，但可以傳遞DNA表達，包括腺病毒、逆轉錄病毒和慢病毒。傳統(tǒng)的非病毒載體包括膠束、脂質體、樹狀聚合物和碳納米管。最近，由細胞分泌的細胞外囊泡，特別是外泌體，已被用作基因遞送的非病毒載體，并顯示出高生物相容性、低清除率和適合細胞靶向傳遞的特性。雜合基因遞送技術，如外泌體-AAV雜交等，將病毒載體與非病毒載體結合使用，并顯示出顯著降低的免疫原性。該文重點探討基于病毒囊泡和外泌體的基因遞送載體。
外泌體是直徑為40-160 nm的脂質雙層包裹的囊泡，在細胞外環(huán)境中循環(huán)。它們起源于晚期內體膜的內部出芽，并且被所有細胞類型釋放。因此，外泌體是細胞間通訊的天然載體。然后，此功能誘使研究人員開發(fā)基于外泌體的藥物遞送系統(tǒng)。與其他基因遞送系統(tǒng)相比，由于以下原因，外泌體是有利的。首先，外泌體是多功能載體。外泌體可以包裹并遞送各種生物貨物，例如小RNA、mRNA和蛋白質。第二，外泌體具有穿越生物屏障（例如血腦屏障）的天然能力。它們也可以遷移到?jīng)]有血液供應的組織或區(qū)域，例如致密的軟骨基質。此外，在到達目標組織后，外泌體可以在那里停留很長一段時間。清除率低歸因于外泌體的生物相容性。另一個重要特征是外泌體可以基因工程改造。通過改造外泌體的表面蛋白可以實現(xiàn)多種目的，例如，可以將靶向細胞或組織的肽附加在外泌體的表面上，以實現(xiàn)針對特定組織的選擇性靶向，避免在其他器官中不必要的積累，從而降低全身毒性。研究表明，基于外泌體的靶向基因療法可以增強治療功效和安全性。例如，研究人員設計了一種基于外泌體的軟骨細胞靶向miRNA遞送系統(tǒng)，用于軟骨缺損修復。在這項工作中，軟骨細胞親和肽（CAP）在外泌體表面表達，并且miR-140被裝載在外泌體內部。與封裝在沒有表面修飾的外泌體中的miRNA相比，CAP-外泌體/miRNA復合物的關節(jié)內注射顯示出軟骨的選擇性和長期富集，并且對軟骨缺損的治療功效顯著提高。與外泌體的結合可以減輕毒性并減輕AAV載體的快速清除。AAV載體具有諸如中和體內抗AAV抗體的快速清除和脫靶遞送（通常到肝臟）的缺點。Maguire等在2012年證明AAV載體的一部分與微囊泡/外泌體有關。在電子顯微鏡下，AAV衣殼與微囊泡的表面和內部締合。從細胞培養(yǎng)基中純化的與外泌體相關的AAV（Exo-AAV）（圖3）在轉導效率方面優(yōu)于常規(guī)純化的AAV載體。AAV載體的一個顯著問題是，它會誘導強效的長期體液應答，包括與AAV載體結合并抑制轉導的中和抗體（NAb）和標記病毒的非Nabs。因此，NAb會對AAV介導的基因治療的功效以及AAV載體的分布和安全性產(chǎn)生不利影響。相比之下，與傳統(tǒng)AAV相比，exo-AAV對中和抗AAV抗體的抵抗力更高。這已經(jīng)被實驗證明。在體外和體內，與外泌體相關的AAV載體對NAb的抵抗力均高于AAV，在存在和不存在Nabs的情況下，AAV9Exo-SERCA2a在駐留心臟功能方面均優(yōu)于常規(guī)AAV載體。Exo-AAV8基因的遞送降低了治療劑量，并實現(xiàn)了有效的轉導。Exo-AAV在中樞神經(jīng)系統(tǒng)以及聽覺和前庭系統(tǒng)中也顯示出更高的轉導功效。
圖3、分別顯示生產(chǎn)和純化Exo-AAV（上部）和單獨AAV（下部）的不同程序示意圖
在CRISPR序列的指導下，Cas9酶可以在細胞中以前所未有的精度、效率和靈活性編輯基因組DNA。但是，離體設計的CRSPR-Cas9系統(tǒng)需要遞送到目標細胞和生物中進行基因治療。CRISPR-Cas9系統(tǒng)的傳遞可通過物理相互作用、化學修飾和生物載體實現(xiàn)。CRISPR-Cas9系統(tǒng)可通過脂質雙分子層中的短暫間隙被輸送到細胞中，該間隙由物理方法引起，例如電穿孔、流體動力注射、膜變形等。盡管簡單易行，但可能對細胞膜造成不可逆的生理損傷。CAS9-sgRNA的化學修飾還將使它能夠傳遞到細胞，或者諸如噬菌體、病毒和細胞外囊泡等生物載體可以介導CRISPR-Cas系統(tǒng)向細胞的傳遞（表3）。
4.1 外泌體作為CRISPR-Cas9質粒的載體與病毒載體相比，來自某些細胞來源的外泌體可以選擇性地將貨物遞送至腫瘤組織。Kim等報道稱癌細胞來源的外泌體可以將CRISPR-Cas9系統(tǒng)轉運至靶腫瘤。4.2 用于CRISPR-Cas9遞送的工程外泌體天然外泌體并非設計來傳遞大分子，例如質粒。因此，外泌體中質粒的負荷低。然后需要對外泌體進行工程改造，以提高質粒的效率和容量。工程外泌體還賦予了這些轉運納米顆粒以靶向能力，可將貨物轉運至特定細胞或組織。在外泌體表面表達的標志蛋白CD63和CD9通常被選作外泌體工程的靶蛋白。外泌體的納米級尺寸（40–160 nm）使其成為小型治療劑（例如化合物、siRNA和miRNA）的合格載體。對于大分子，例如最小大小為5–6 kb的CRISPR-Cas9表達質粒，天然外泌體的容量仍然相對較低。另一方面，脂質體能夠包封和傳遞大質粒，但由于脂質的非天然性質，具有較高的細胞毒性。外泌體膜的脂質雙層與脂質體的融合形成了外泌體-脂質體雜合體，從而可以包裹和遞送大型DNA分子，例如CRISPR-Cas9表達質粒，還減輕了脂質體的毒性問題（圖4）。因此，外泌體-脂質體的雜交擴大了外泌體在藥物輸送中的應用范圍。
將大的mRNA轉錄物封裝進外泌體是一項艱巨的任務。盡管天然分泌的外泌體包含多種RNA，包括miRNA、ncRNA和片段，但大多數(shù)片段很小。大的mRNA分子可通過電穿孔從紅細胞轉移至外泌體，但這一過程仍然效率低下。鑒于這一障礙， 楊等提出了一種可大規(guī)模產(chǎn)生攜帶功能性mRNA外泌體的方法（相關報道：Nature子刊：細胞納米穿孔可大規(guī)模產(chǎn)生攜帶功能性mRNA的外泌體）。這項工作開發(fā)了具有約500 nm直徑的納米通道的細胞納米穿孔生物芯片。作者用質粒DNA轉染了細胞，并通過局部和瞬時電刺激刺激了轉染的細胞。這種納米穿孔程序促進了攜帶轉錄的mRNA和靶向肽的外泌體從細胞中釋放，導致外泌體增加多達50倍，外泌體mRNA轉錄產(chǎn)物增加了超過103倍，每個外泌體估計可達到2-10個完整的功能性mRNA。通過設計的載體對基因載體進行組織或細胞特異性遞送，可以實現(xiàn)具有降低的毒性或風險的基因治療的高級版本。來自細胞源，外泌體的載體可以介導各種基因治療分子或載體的遞送。特別是，通過外泌體的遺傳或化學工程，可以將特異性識別序列安裝在外泌體的外部，以指導貨物的靶向遞送，或者可以通過外泌體標記蛋白來設計蛋白-蛋白相互作用富集靶蛋白。此外，具有核酸結合特性的工程外泌體也將有助于質粒或載體的包封并提高加載效率。將外泌體與脂質體融合將形成囊泡，該囊泡可以封裝大質?；騧RNA轉錄本，同時保留外泌體的優(yōu)勢，例如生物相容性和靶向能力。作為邁向臨床試驗的重要一步，在實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)外泌體或載藥外泌體方面也取得了進展。納米穿孔等儀器和程序的突破也解決了裝載和生產(chǎn)的瓶頸。綜上所述，隨著基因編輯工具的發(fā)展和優(yōu)化，基于外泌體的載體系統(tǒng)的不斷發(fā)展將為靶向基因療法提供動力，從而通過體外和體內途徑將其作為未來難治疾病的可行療法（圖 5）。
DuanL, Xu L, Xu X, Qin Z, Zhou X, Xiao Y, Liang Y, Xia J. Exosome-mediated deliveryof gene vectors for gene therapy. Nanoscale. 2020 Dec 22.doi: 10.1039/d0nr07622h. Epub ahead of print. PMID: 33350419.
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