Existence of intratumoral tertiary lymphoid structures is associated with immune cells infiltration and predicts better prognosis in early stage hepatocellular carcinoma

腫瘤內(nèi)三級淋巴樣結(jié)構(gòu)的存在與免疫細(xì)胞浸潤有關(guān)，在預(yù)測早期肝細(xì)胞癌方面效果更好

一、研究背景

肝細(xì)胞癌（HCC）是全球最常見的癌癥之一，具有較高的死亡率和復(fù)發(fā)率，目前肝切除和肝移植等外科手術(shù)仍是治療HCC的主要手段。三級淋巴結(jié)構(gòu)（TLS）是異位淋巴器官，其在包括腫瘤在內(nèi)的慢性炎癥部位的非淋巴組織中發(fā)展，隨著人們對免疫療法的日益關(guān)注，有相關(guān)的研究表明三級淋巴樣結(jié)構(gòu)（TLS）的形成是潛在的抗腫瘤免疫反應(yīng)，而過往也有研究顯示TLS與各種實(shí)體瘤的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)降低和更好的總生存期（OS）相關(guān)聯(lián)。在本篇文章中，作者就以此為切入點(diǎn)，對TLS和肝細(xì)胞癌的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)系進(jìn)行了探究。

二、分析思路

三、結(jié)果解讀

1、患者的臨床病理特征

作者在經(jīng)過了肝切除外科手術(shù)的HCC患者中選取了303人作為training cohort，159人作為validation cohort根據(jù)HE染色的結(jié)果將training cohort中的患者分為四類：缺少TLS、存在淋巴樣聚集體、無生發(fā)中心的淋巴濾泡、有生發(fā)中心的淋巴濾泡。染色情況如圖1所示

圖1：HE染色的分組情況

2、TLS可降低復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)

• 分組后，作者探索了TLS與各種臨床特征之間的關(guān)系。在圖2中，我們關(guān)注到了以下信息：肝切除術(shù)后兩年內(nèi)的復(fù)發(fā)率（early recurrence）達(dá)到了29.7％，不過TLS含量多的患者的復(fù)發(fā)率（19.6％）明顯低于TLS含量較少的患者（34.8％），從這里我們似乎就可以發(fā)現(xiàn)TLS可以降低復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。但是，從5年的生存情況來看，二者的差別就不明顯了（p=0.464）

圖2：TLS與各種臨床特征的關(guān)系

從上面的結(jié)果中，作者推測TLS降低復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)可能只適用于早期的患者，所以作者又選取了BCLC 分期為 0-A 期的HCC患者，分析了TLS和各種臨床特征之間的關(guān)系。（BCLC，巴塞羅那分期，是一種肝癌的臨床分期系統(tǒng)，0-A期即為早期）從圖3中可以發(fā)現(xiàn)：富含TLS的患者2年內(nèi)有著較低的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)（15.9％vs33.8％），而5年的生存狀況仍無差異（p=0.499）

圖3：HCC早期患者中TLS與臨床特征的關(guān)系

作者在validation cohort中進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果與training cohort相印證。

不過，除早期腫瘤的復(fù)發(fā)率外，TLS與其他任何臨床，生物學(xué)或病理學(xué)特征均不相關(guān)。

• 接下來，作者繪制了KM生存曲線，KM曲線顯示：TLS與總生存期沒有顯著相關(guān)（A圖）；富含TLS的患者有更好的RFS（無復(fù)發(fā)生存率），不過只局限于早期的RFS，隨著時(shí)間的推移，RFS與TLS含量少的患者區(qū)別不大（BCD圖）此外，E圖和F圖顯示具有淋巴濾泡的患者的早期復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)低于僅有淋巴樣聚集體的患者（P = 0.045），這表明TLS的成熟度對預(yù)后有影響。

圖4：KM生存曲線

ROC曲線也證明了這一結(jié)果，在training cohort中，RFS和早期RFS的AUC分別為0.64和0.715；在肝癌早期的患者中（BCLC 0-A），RFS和早期RFS的AUC分別為0.682和0.798

圖5

• 接下來，作者研究哪些因素可能是獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)。作者在training cohort中首先使用單因素Cox分析篩選與患者OS、RFS有關(guān)的變量，得到了一系列與OS、RFS顯著相關(guān)的變量，隨后選取這些變量進(jìn)行多因素Cox分析，部分結(jié)果如圖6（上）所示。結(jié)果表明：HBV DNA升高，HCV感染，較大的腫瘤大小和微血管浸潤是OS的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)。

• 當(dāng)然，這一步的分析也與前面關(guān)于TLS的結(jié)論相佐證。從圖6（下）中，我們可以發(fā)現(xiàn)TLS是早期腫瘤復(fù)發(fā)的獨(dú)立預(yù)測因素，但不是晚期腫瘤復(fù)發(fā)的獨(dú)立預(yù)測因素。

圖6

• 由于潛在的異質(zhì)性的存在，療效往往會隨著患者的特點(diǎn)而變化，于是作者進(jìn)行了亞組分析來明確研究結(jié)論。亞組分析顯示，TLS除了對肝癌早期的患者有預(yù)測價(jià)值，對于伴結(jié)節(jié)的肝癌患者也有預(yù)后預(yù)測價(jià)值。

3、TLS與免疫浸潤相關(guān)

這一步其實(shí)相當(dāng)于機(jī)制層面的研究，據(jù)報(bào)道，TLS可能會導(dǎo)致腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞促進(jìn)抗腫瘤免疫反應(yīng)，而高含量的CD8+會帶來較好的預(yù)后。在本篇文章中，作者評估了染色的免疫浸潤水平，發(fā)現(xiàn)在富含TLS 的病例中CD3 +和CD8 + T細(xì)胞的腫瘤浸潤增加，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)了更多的CD 20+細(xì)胞的腫瘤浸潤。此外，因?yàn)镕oxp3 +調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Foxp3 + Tregs）和巨噬細(xì)胞（CD68 +）的浸潤程度與TLS的含量呈負(fù)相關(guān)，因此在TLS +組中它們的水平明顯較低。

此外，由于HCC涉及多種免疫抑制機(jī)制，作者也驗(yàn)證了幾個(gè)免疫檢查點(diǎn)分子的表達(dá)水平，在富含TLS 的病例中，作者觀察到PD1 +細(xì)胞，TIM3 +細(xì)胞和LAG3 +細(xì)胞數(shù)量減少。但是，沒有觀察到TLS和PD-L1免疫細(xì)胞之間有顯著的關(guān)聯(lián)。

圖7：TLS和幾種免疫細(xì)胞的關(guān)系