一、研究背景

        肺癌是致死率很高的疾病，其中一個(gè)重要的亞型就是肺腺癌（LUAD），大多數(shù)患者因?yàn)闆](méi)有特殊的早期癥狀而錯(cuò)過(guò)了最佳手術(shù)時(shí)間，而放療和化療的治愈率又不高。越來(lái)越多的研究證據(jù)表明免疫治療是肺癌的重要治療手段，因此在本研究中，作者關(guān)注免疫風(fēng)險(xiǎn)與LUAD預(yù)后的關(guān)系，希望生成一個(gè)可以作為L(zhǎng)UAD獨(dú)立預(yù)后因素的免疫相關(guān)基因標(biāo)志物。

二、分析流程

三、結(jié)果解讀

1、根據(jù)免疫評(píng)分篩選LUAD預(yù)后標(biāo)志物

• 首先作者下載了TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中489例LUAD患者的RNA-seq數(shù)據(jù)，作為本研究的訓(xùn)練集，樣本的臨床特征如表1所示

• 接著，作者利用ESTIMATE算法計(jì)算所有樣本的免疫評(píng)分和基質(zhì)評(píng)分，以中位數(shù)作為cut-off將所有患者分別分為高/低基質(zhì)評(píng)分組、高/低免疫評(píng)分組，并依次做兩種分組下的KM生存分析。結(jié)果顯示：按照基質(zhì)評(píng)分分組時(shí)，KM生存分析的結(jié)果沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p=0.0567）；而按照免疫評(píng)分分組時(shí)，高免疫評(píng)分組的中位OS要高于低免疫評(píng)分組（p=0.0154），說(shuō)明免疫評(píng)分的高低對(duì)LUAD患者的預(yù)后有影響。（圖1.A、B）

• 為了找出與LUAD預(yù)后有關(guān)的免疫基因， 作者利用R包limma對(duì)訓(xùn)練集患者的RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并繪制了火山圖，結(jié)果顯示高免疫評(píng)分組中有1000個(gè)基因上調(diào)，10個(gè)基因下調(diào)。（圖1.C）

• 最后，作者利用LASSO COX回歸模型對(duì)上述1010個(gè)DEGS進(jìn)行篩選，得到9個(gè)與LUAD預(yù)后有關(guān)的免疫相關(guān)基因和它們對(duì)應(yīng)的系數(shù)，由此得出一個(gè)9個(gè)基因構(gòu)成的LUAD風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分公式：(? 0.014940631× SFTPD status) + (? 0.012603532 × P2RY13 status) +(? 0.053977327 × HLA‐DMA status) + (0.139652398 ×BIRC3 status) + (? 0.04205445 × BTK status) +(? 0.022676019 × CLEC7A status) + (? 0.031509498 ×HLA‐DOB status) + (? 0.043072174 × CD5 status) +(? 0.020106152 × MS4A1 status)

2、9基因標(biāo)志物的預(yù)后價(jià)值驗(yàn)證

• 作者取GEO數(shù)據(jù)庫(kù)的GSE30219數(shù)據(jù)集作為驗(yàn)證集，對(duì)訓(xùn)練集和驗(yàn)證集樣本分別計(jì)算免疫評(píng)分，并進(jìn)行KM生存分析，均發(fā)現(xiàn)與地免疫風(fēng)險(xiǎn)組相比，高免疫風(fēng)險(xiǎn)組患者的中位OS明顯較低，預(yù)后較差。（圖2）

3、9基因標(biāo)志物預(yù)后獨(dú)立性檢驗(yàn)

• 作者對(duì)訓(xùn)練集樣本做單因素、多因素cox回歸分析，設(shè)置了年齡、性別、TNM分期等多個(gè)LUAD臨床預(yù)后標(biāo)志物作為變量，發(fā)現(xiàn)本文中的9基因標(biāo)志物的預(yù)后價(jià)值獨(dú)立于其他預(yù)后因素。（表2）

表2.單因素、多因素cox回歸分析結(jié)果

• 在此基礎(chǔ)上作者進(jìn)一步驗(yàn)證了這個(gè)9基因的預(yù)后標(biāo)志物可以預(yù)測(cè)不同臨床亞組患者的生存情況，在圖3中，作者將訓(xùn)練集患者分為年齡大于/小于等于65歲、男/女性、T1-T2/T3-T4分期、TNM1-2/3-4期、N0/N1-3分期、M0/M1、有無(wú)復(fù)發(fā)共14個(gè)臨床亞組，分別進(jìn)行KM生存分析，發(fā)現(xiàn)在除去T3-T4分期、N1-3分期、M1、TNM3-4期以外其他所有臨床亞組中，低免疫風(fēng)險(xiǎn)組患者的預(yù)后更為良好。

4、9基因標(biāo)志物的臨床應(yīng)用

• 為了將這個(gè)9基因預(yù)后標(biāo)志物應(yīng)用到LUAD患者的臨床預(yù)后預(yù)測(cè)中，作者把9基因預(yù)后標(biāo)志物和其他臨床預(yù)后因素共同作為變量構(gòu)建了一個(gè)列線圖，并利用R包rmda繪制了列線圖的calibration curve（校準(zhǔn)圖），3年、5年、10年的校準(zhǔn)圖曲線均接近斜率45度的直線，說(shuō)明利用該列線圖得到的預(yù)測(cè)值與實(shí)際觀測(cè)值非常接近，同時(shí)計(jì)算出該列線圖的C-index值為0.722，共同說(shuō)明了這個(gè)基于9基因預(yù)后標(biāo)志物的列線圖具有良好的預(yù)測(cè)能力（圖4）

5、與9基因標(biāo)志物相關(guān)的通路分析

• 為了更好地了解9基因標(biāo)志物潛在的細(xì)胞生物學(xué)功能，作者對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中230個(gè)LUAD樣本進(jìn)行KEGG和GO分析。在圖5.A中給出了GO分析中富集分?jǐn)?shù)排名前20的相關(guān)通路，包括炎癥反應(yīng)、適應(yīng)性免疫反應(yīng)等；在圖5.B中給出了KEGG分析的結(jié)果，與9基因標(biāo)志物相關(guān)的通路也基本與免疫反應(yīng)有關(guān)，包括趨化因子信號(hào)通路、NF-kB信號(hào)通路等。