雖然MC目前2018年的IF是10.679，但是我們之所以說(shuō)是15+分呢，是因?yàn)镸C在6月就要公布在2019年的影響因子是15.96分，說(shuō)不定還能在這段時(shí)間努努力，突破到16分！

(圖片來(lái)源：桑格助手)

一.研究背景

越來(lái)越多的證據(jù)表明，m⁶A修飾通過(guò)與多種m⁶A調(diào)節(jié)因子的相互作用，在炎癥、先天免疫、抗腫瘤等方面發(fā)揮著不可或缺的作用。由于大多數(shù)研究集中在單個(gè)TME細(xì)胞類型或單個(gè)調(diào)控因子上，因此由多個(gè)m⁶A調(diào)控因子綜合作用介導(dǎo)的TME整體浸潤(rùn)特征并未得到全面認(rèn)識(shí)。明確不同m⁶A修飾模式在TME細(xì)胞浸潤(rùn)中的作用，有助于加深對(duì)TME抗腫瘤免疫反應(yīng)的認(rèn)識(shí)，指導(dǎo)更有效的免疫治療策略。

二.分析流程

1.m6Ascore模型的建立

2.m6A修飾模式聯(lián)系TME浸潤(rùn)特性

對(duì)應(yīng)“結(jié)果解讀”中圖1-2（部分）

3.m6Asocre聯(lián)系TME浸潤(rùn)特性

對(duì)應(yīng)“結(jié)果解讀”中圖2-4

4.TCGA-STAD中m6Ascore對(duì)于免疫療法的價(jià)值

對(duì)應(yīng)“結(jié)果解讀”中圖5-6

三.結(jié)果解讀

1.胃癌m⁶A調(diào)節(jié)因子的遺傳變異情況

首先先介紹下作者對(duì)胃癌數(shù)據(jù)集和預(yù)處理：本研究從GEO、TCGA共收集了7個(gè)符合條件的GC組。符合條件的GC數(shù)據(jù)集的基本信息匯總在表S1中。

• 對(duì)于來(lái)自Affymetrix?的微陣列數(shù)據(jù)，下載原始CEL文件，采用多陣列平均方法，使用affy和simpleaffy包作背景調(diào)整和分位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化。

• 對(duì)于TCGA數(shù)據(jù)集基因表達(dá)的RNAsequencing 數(shù)據(jù)(FPKM值)從GDC下載，使用R包TCGAbiolinks 進(jìn)行整合分析。

• FPKM值轉(zhuǎn)換為轉(zhuǎn)錄本每千堿基百萬(wàn)(TPM)值。利用R sva包對(duì)非生物技術(shù)偏差的bacth effect（批量效應(yīng))進(jìn)行了校正。

本研究作者共確定了21個(gè)m⁶A調(diào)節(jié)因子，包括8個(gè)甲基化酶、2個(gè)去甲基化酶和11個(gè)結(jié)合蛋白。作者總結(jié)展示了調(diào)控因子介導(dǎo)的m⁶A RNA甲基化的動(dòng)態(tài)可逆過(guò)程及其潛在的RNA生物學(xué)功能（圖1A）。

然后總結(jié)了GC中21個(gè)m⁶A調(diào)節(jié)因子拷貝數(shù)變異（CNV）和體細(xì)胞突變的發(fā)生率：

• 在TCGA-STAD隊(duì)列433個(gè)樣本中，有101個(gè)m⁶A調(diào)節(jié)因子發(fā)生突變，頻率為23.33%。發(fā)現(xiàn)ZC3H13突變頻率最高，KIAA1429次之，而去甲基化酶(FTO和ALKBH5)和METTL3在GC樣品中均未發(fā)生突變(圖1B)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，ELAVL1與KIAA1429、YTHDF1和ZC3H13、RBM15和YTHDC1之間存在顯著的突變共現(xiàn)關(guān)系(圖S1B)
  

  

  圖S1B.21個(gè)m⁶A調(diào)節(jié)因子的共現(xiàn)分析
  

• 對(duì)GSE62717隊(duì)列中CNV改變頻率的調(diào)查顯示，21個(gè)調(diào)控因子中CNV的改變較為普遍，主要集中在拷貝數(shù)的擴(kuò)增上，而ELAVL1、YTHDF2和FMRI中CNV的缺失較為普遍(圖1C)。

• m⁶A調(diào)節(jié)子在染色體上CNV改變的位置如圖1D所示。

  根據(jù)21m⁶A調(diào)節(jié)因子的表達(dá)，區(qū)分出GC樣品和正常樣品(圖1E)。

  為了確定上述基因變異是否影響胃癌患者m⁶A調(diào)節(jié)因子的表達(dá)，作者調(diào)查了正常與GC樣品間調(diào)節(jié)因子mRNA表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)CNV的改變可能是干擾m⁶A調(diào)節(jié)因子表達(dá)的重要因素。與正常胃組織相比,在GC組織m⁶A調(diào)節(jié)因子與擴(kuò)增 CNV顯著高表達(dá)(例如CBLL1和FTO),反之亦然(例如ELAVL1和YTHDF2)(圖1 C、F)。

2.m⁶A甲基化修飾模式由21個(gè)調(diào)控因子介導(dǎo)

作者將 5個(gè)GEO數(shù)據(jù)集納入一個(gè)meta隊(duì)列。作單變量Cox回歸模型，顯示21個(gè)m⁶A調(diào)節(jié)因子在胃癌患者中的預(yù)后價(jià)值（圖S1C）。

圖2A作了m⁶A調(diào)節(jié)因子網(wǎng)絡(luò)分析：描述了m⁶A調(diào)節(jié)因子相互作用、調(diào)節(jié)因子連接及其對(duì)胃癌患者預(yù)后的影響。

圖S2A-H：作者writer、eraser基因表達(dá)的關(guān)聯(lián)顯著。而且發(fā)現(xiàn)writer基因高表伴隨的eraser基因低表達(dá)的現(xiàn)象實(shí)際上取決于不同的writer基因和eraser基因：writer基因(WATP和RBM15)高表達(dá)的腫瘤，其eraser基因FTO的表達(dá)較低，而WATP和RBM15的高表達(dá)則不影響另一個(gè)eraser基因ALKBH5的表達(dá)（圖S2A-B）。

圖S2l:與野生型相比，ZC3H13突變型腫瘤中ALKBH5表達(dá)明顯上調(diào)，而FTO表達(dá)明顯下調(diào)。

將GEO五個(gè)隊(duì)列1051個(gè)患者樣本作一致性聚類分析，分為了三個(gè)亞群：A（n=389）、B（n=348）和C（n=322）。然后對(duì)三種主要m⁶A修飾亞型的預(yù)后分析顯示，m⁶A亞群B修飾模式具有更好的OS(圖2B)。

為了探索這些不同的m⁶A修飾模式之間的生物學(xué)行為，作者進(jìn)行了GSVA富集分析（圖2C)。

• m⁶A亞群A顯著富集了ECM受體相互作用、TGF -信號(hào)通路、細(xì)胞粘附、MAPK信號(hào)通路等間質(zhì)激活致癌通路。

• m⁶A亞群B表達(dá)了與免疫完全激活相關(guān)的富集通路，包括趨化因子信號(hào)通路的激活、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、T細(xì)胞受體信號(hào)通路和Toll樣受體信號(hào)通路(圖2C)。

• 而m⁶A亞群C與免疫抑制生物學(xué)過(guò)程顯著相關(guān)。(圖2D)

3.TME細(xì)胞浸潤(rùn)特征和轉(zhuǎn)錄組特征

• 圖3A：接著對(duì)TME細(xì)胞浸潤(rùn)的分析顯示，亞群A明顯富含天然免疫細(xì)胞浸潤(rùn)，包括自然殺傷細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、MDSC、漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞。

• 圖3B：后續(xù)分析顯示,亞群A的基質(zhì)顯著增強(qiáng)如激活EMT、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGFb)和血管生成途徑的激活,證實(shí)了作者基于GSVA分析結(jié)果:A基質(zhì)的激活可能抑制了免疫細(xì)胞的抗腫瘤作用。

• 作者依據(jù)三個(gè)亞群的GSVA分析結(jié)果和免疫浸潤(rùn)情況，將三亞群表型歸類：

• 然后，使用spearman的相關(guān)分析來(lái)檢驗(yàn)每個(gè)TME浸潤(rùn)細(xì)胞類型和每個(gè)m⁶A調(diào)節(jié)因子之間的具體相關(guān)性(圖S3A)。

  重點(diǎn)研究了調(diào)節(jié)因子KIAA1429：

• 圖S3B：ESTIMATE算法量化KIAA1429，KIAA1429低表達(dá)時(shí)免疫評(píng)分較高。

• 圖S4C：23種TME浸潤(rùn)免疫細(xì)胞在KIAA1429高、低表達(dá)患者中的特異性差異分析我們發(fā)現(xiàn)KIAA1429低表達(dá)的腫瘤在23個(gè)TME免疫細(xì)胞中浸潤(rùn)明顯增加(圖S3C)。

• 圖S3D：KIAA1429的表達(dá)降低導(dǎo)致MHC分子、共刺激分子和粘附分子的表達(dá)全面升高。

• 圖S3E：KIAA1429的通路富集分析。

• 圖S3F：在抗PD-L1免疫治療隊(duì)列中，KIAA1429低表達(dá)患者具有更好的OS。

• 綜上作者推測(cè)KIAA1429介導(dǎo)的m6A甲基化修飾可能促進(jìn)TME樹(shù)突細(xì)胞的激活，從而增強(qiáng)瘤內(nèi)抗腫瘤免疫應(yīng)答。

• 圖3D：作者進(jìn)一步用ACRG隊(duì)列探討分析m⁶A修飾表型在不同臨床特征和生物學(xué)行為中的特征（n=300）。ACRG隊(duì)列的聚類分析顯示了三種完全不同的m⁶A修飾模式(圖3c-d)。三種不同的m⁶A修飾模式在m⁶A轉(zhuǎn)錄譜上存在顯著差異。

• 圖3E：m⁶Acluster-A甲基化修飾模式以EMT分子亞型為特征，m⁶Acluster-B甲基化修飾模式以MSI亞型為特征。

作者接著使用limma包測(cè)定了718個(gè)m⁶A表型相關(guān)的DEGs。然后用clusterProfiler包對(duì)DEGs作GO富集分析。結(jié)果顯示這些基因表現(xiàn)出豐富的與m⁶A修飾和免疫顯著相關(guān)通路，證實(shí)m⁶A修飾在腫瘤微環(huán)境的免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著不可忽視的作用(圖3F)。

4.m⁶A基因標(biāo)記和功能注釋的產(chǎn)生

根據(jù)獲得的718個(gè)m⁶A表型相關(guān)基因進(jìn)行無(wú)監(jiān)督聚類分析，將患者分為不同的基因組亞型。與m⁶A修飾模式的聚類結(jié)果一致，聚類也發(fā)現(xiàn)了三個(gè)具有不同的特征基因不同的m⁶A基因簇（圖4A)。

接著對(duì)三個(gè)基因簇的患者作了KM生存分析，顯示m⁶A基因簇A具有更好的OS，其次是基因簇B以及基因簇C(圖4B)。在三個(gè)m⁶A基因簇中，m⁶A調(diào)控因子的表達(dá)存在顯著差異(圖4C)。

作者考慮到m⁶A修飾的個(gè)體異質(zhì)性和復(fù)雜性，基于這些表型相關(guān)基因，構(gòu)建了一套評(píng)分系統(tǒng)來(lái)量化胃癌個(gè)體患者的m⁶A修飾模式，稱之為m⁶Ascore。用沖積圖顯示了m⁶Aclusters、ACRG分子亞型、基因簇和m⁶Ascore的變化(圖4D)。

• 為了更好地說(shuō)明m⁶A特征，作者利用Spearman分析m⁶Ascore與ACRG隊(duì)列中已知基因特征的相關(guān)性。負(fù)相關(guān)用藍(lán)色表示，正相關(guān)用橙色表示(圖4E)。

• 作Kruskal-Wallis檢測(cè)顯示m⁶A基因簇在m⁶Ascore上存在顯著差異?；虼谹的中位得分最低，而基因簇C的中位得分最高，說(shuō)明m⁶Ascore含量低可能與免疫激活相關(guān)特征密切相關(guān)，而m⁶Ascore含量高可能與基質(zhì)激活相關(guān)特征密切相關(guān)(圖4F)。

• 而對(duì)3個(gè)m⁶A亞群作Kruskal-Wallis，顯示m⁶A亞群A較B、C亞群m⁶Ascore明顯增加(圖4G)。對(duì)基質(zhì)相關(guān)通路活性的分析表明，高m⁶Ascore可能對(duì)基質(zhì)激活通路有影響(圖4H)。

5.m⁶Ascore與TME表型特征的聯(lián)系

m⁶Ascore與ACRG亞型：

• 圖5A:采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)比較四種ACRG分子亞型間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，與其他三種ACRG分子亞型相比，EMT亞型患者的m⁶Ascore最低。

• 圖5B:作者進(jìn)一步探究m⁶Ascore在預(yù)測(cè)患者預(yù)后方面的價(jià)值。將患者分為低m⁶Ascore組和高m⁶Ascore組后，作KM生存分析，低m⁶Ascore患者具有更好的OS。

• 圖5C：然后檢測(cè)了m⁶Ascore預(yù)測(cè)胃癌患者輔助化療療效的能力。發(fā)現(xiàn)m⁶Ascore低且同時(shí)接受輔助化療的患者具有更好的OS。

• 圖S6A：多變量Cox回歸模型，證實(shí)m⁶Ascore是獨(dú)立預(yù)后因素。

• 圖S6B：m⁶Ascore與臨床特征的關(guān)聯(lián)。

作者在TCGA-STAD中作了驗(yàn)證:

• TCGA-STAD將胃癌分為基因組穩(wěn)定型(GS)、微衛(wèi)星不穩(wěn)定型(MSI)、EBV感染和染色體不穩(wěn)定型(CIN) 4個(gè)分子亞型。作者評(píng)估了m⁶Ascore在這些分子亞型之間的差異:顯示高m⁶Ascore明顯集中于GS亞型，患者OS差；低m⁶Ascore則集中于MSI、EBV感染亞型，OS較好(圖5D-E)。

• 接著探究不同微衛(wèi)星亞型間m⁶Ascore差異。微衛(wèi)星高不穩(wěn)定性亞型（MSI-H）的m⁶Ascore值較低，而MSI-L和MSS的m⁶Ascore值較高(圖5F)。

• 然后，利用maftools軟件包分析了TCGA-STAD隊(duì)列中低、高m⁶Ascore體細(xì)胞突變的分布差異。如圖5G-H所示，低m⁶Ascore組（圖5H）較高m⁶Ascore組（圖5G）有更廣泛的腫瘤突變負(fù)荷。

• 根據(jù)高TMB狀態(tài)的患者對(duì)抗pd -1/PD-L1免疫治療有持久的臨床反應(yīng)。證實(shí)m⁶Ascore在預(yù)測(cè)免疫治療結(jié)果中的價(jià)值。

    微衛(wèi)星狀態(tài)和EBV感染：

• 圖S7A：從三種m⁶A修飾模式在MSI和MSS亞型中的比例進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)：cluster-B主要以MSI亞型為特征，而cluster-C以MSS亞型為特征。

• 圖S7B：MSS/MSI亞型中m⁶A調(diào)節(jié)因子的表達(dá)情況。

• 圖S7C：EB病毒感染在三個(gè)cluster的比例。

• 圖S7D：EBV陽(yáng)性/陰性m⁶A調(diào)節(jié)因子的表達(dá)情況。

• 圖S7E：TMB定量分析：低m⁶Ascore呈現(xiàn)高TMB。

• 圖S7F：相關(guān)性分析，m⁶Ascore與TMB也呈顯著負(fù)相關(guān)。

6.m⁶A甲基化修飾模式與腫瘤免疫表型及抗pd -1/L1免疫治療反應(yīng)顯著相關(guān)

作者將ACRG隊(duì)列中建立的m⁶Ascore：

• 圖S8A-S8C：應(yīng)用于其他獨(dú)立的胃癌隊(duì)列中，驗(yàn)證其預(yù)后價(jià)值。

• 圖S8D：對(duì)所有GEO隊(duì)列的組合進(jìn)行了驗(yàn)證。

• 圖S8E-S8F：評(píng)估m⁶Ascore預(yù)測(cè)RFS的能力。

• 圖S8G：繼續(xù)擴(kuò)展到TCGA的所有消化系統(tǒng)腫瘤。這些數(shù)據(jù)表明m⁶A修飾模式與更好的臨床療效相關(guān)。

• 圖S8H-S8I：ROC曲線顯示m⁶A預(yù)測(cè)優(yōu)勢(shì)在老年患者中尤為明顯。

作者又基于兩個(gè)免疫治療隊(duì)列:抗PD-L1隊(duì)列(IMvigor210)和抗PD-1隊(duì)列(GSE78220)，研究m⁶A修飾簽名是否可以預(yù)測(cè)患者對(duì)免疫檢查點(diǎn)阻斷治療的反應(yīng)。

• 對(duì)兩個(gè)隊(duì)列作KM生存分析，兩隊(duì)列（圖6A:IMvigor210；圖6D:GSE78220）低m⁶Ascore患者均具有較好的OS。

• 通過(guò)對(duì)兩隊(duì)列中低、高m⁶Ascore組患者對(duì)阻斷PD-L1(圖6b)和PD-1（圖6E）免疫治療反應(yīng)比例分析，顯示低m⁶Ascore比高m⁶Ascore患者抗PD-1/L1免疫治療具有顯著臨床療效優(yōu)勢(shì)(圖6B-C，E-F，G-H)。

• 對(duì)低m⁶Ascore組和高m⁶Ascore組間基質(zhì)激活通路和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞豐度分析，顯示高m⁶Ascore組的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞豐度顯著提升，以及TME基質(zhì)通路顯著激活(圖6I)。

• 又將m⁶Ascore合并腫瘤新生抗原負(fù)荷作KM分析，顯示低m⁶Ascore、高腫瘤新生抗原負(fù)荷的患者具有更好的OS(圖6J)。

• 對(duì)m⁶Ascore在抗pd -1/L1免疫治療患者中的預(yù)后價(jià)值分析：ROC曲線（AUC=0.768）顯示m⁶Ascore是一種可靠的免疫治療預(yù)后和臨床反應(yīng)評(píng)估的生物標(biāo)志物(圖6K)。

• 最后利用IMvigor210隊(duì)列中已知的腫瘤免疫表型，來(lái)對(duì)m⁶Ascore在不同表型之間差異進(jìn)行分析：顯示免疫排斥表型、免疫沙漠表型的m⁶Ascore較高(圖6L)。

最后我們總結(jié)一下：作者以胃癌為例，在1938個(gè)胃癌樣本mRNA表達(dá)譜的基礎(chǔ)上，充分評(píng)估了21個(gè)m⁶A調(diào)節(jié)因子的狀態(tài)，并將胃癌患者分為三組m⁶A甲基化修飾模式，通過(guò)對(duì)三組修飾模式的差異分析，發(fā)現(xiàn)分別與腫瘤的三種免疫表型高度對(duì)應(yīng)，由此建立一套m⁶Ascore的評(píng)分系統(tǒng)。然后證實(shí)m⁶Ascore與胃癌的m⁶A修飾特征、微環(huán)境炎癥水平、基質(zhì)活性、分子亞型、遺傳變異、微衛(wèi)星狀態(tài)以及患者預(yù)后顯著相關(guān)。m⁶A對(duì)于抗PD-1/L1的免疫療法有十分重要的價(jià)值。