芝芪康艾顆粒為蘭州市肺科醫(yī)院感染科的協(xié)定方，由黃芪、黨參、靈芝、魚(yú)腥草、柴胡、甘草等中藥組成，用于治療心神不寧，失眠心悸，肺虛咳喘，虛勞短氣，不思飲食等癥狀［1］。多糖是靈芝的主要有效成分，現(xiàn)代研究證實(shí)，靈芝多糖可促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞與自然殺傷細(xì)胞的功能；促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞成熟、分化及抗原提呈功能；活化淋巴細(xì)胞、增強(qiáng)T細(xì)胞的功能和細(xì)胞因子生成［2］。本研究用正交試驗(yàn)法優(yōu)選靈芝多糖工藝，采用蒽酮－硫酸法［3］對(duì)靈芝多糖進(jìn)行了含量測(cè)定，為建立其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試劑

FA2004B電子分析天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；KH-500DE數(shù)控超聲波清洗器（功率250W，頻率50kHz，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國(guó)華電器有限公司）；UV-2450紫外分光光度計(jì)（島津）。蒽酮（購(gòu)自上海中秦化學(xué)試劑有限公司），硫酸純化水，D-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品（110833-201205）購(gòu)自中國(guó)食品藥品鑒定研究院；靈芝提取物（蘭州市肺科醫(yī)院制劑室生產(chǎn)，批號(hào)分別為20160325、20160411、20160425）。

單樁嵌巖工藝2的具體流程如圖2所示。首先通過(guò)單樁自沉如泥、樁錘沉樁，將單樁打至巖層表面；其次，在單樁內(nèi)部下鉆機(jī)，擴(kuò)孔鉆至設(shè)計(jì)底標(biāo)高處；此后，將鉆機(jī)提出，在單樁內(nèi)下放內(nèi)套管；再次，將內(nèi)套管和鉆孔間灌滿混凝土，即灌漿環(huán)節(jié)；最后，用樁錘繼續(xù)講單樁沉樁至指定標(biāo)高。

2 靈芝多糖的工藝研究和制備

2.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 以加水倍量（A）、提取時(shí)間（B）及提取次數(shù)（D）為考察因素，以靈芝多糖提取量為指標(biāo)，按正交L9（34）進(jìn)行試驗(yàn)，因素水平、正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果和方差分析分別見(jiàn)表1、表2和表3。

我們牙牙學(xué)語(yǔ)時(shí)，父母是最耐心的老師，那時(shí)并不會(huì)想到，父母也會(huì)老，他們會(huì)老到話都說(shuō)不清，會(huì)因?yàn)樵~不達(dá)意大發(fā)雷霆，甚至?xí)屓藷o(wú)可奈何……當(dāng)年老的父母口齒不清時(shí)，怎樣才能和他們更高質(zhì)量的交流呢？

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果 由方差直觀分析，靈芝多糖的極差數(shù)據(jù) RA＞RD＞RB，各因素作用主次為 A＞D＞B，其最佳工藝為A1B3D3。綜合表3方差分析結(jié)果可看出，因素A對(duì)靈芝多糖的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而因素B、D，對(duì)靈芝多糖的影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。為了縮短生產(chǎn)周期，降低生產(chǎn)成本，得最佳提取條件為A1B1D3，即以12、9、9倍水分別提取三次，每次提取時(shí)間40min。

3 靈芝多糖的含量測(cè)定

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別精密吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2ml濃度為0.1mg/ml的葡萄糖對(duì)照品溶液置于10ml具塞試管中，分別加水至2ml，空白對(duì)照加水2ml，依次精密加入硫酸蒽酮溶液6ml，搖勻后置水浴加熱15min，取出，放入冷水浴中冷卻15min，以相應(yīng)的試劑為空白，于625nm處測(cè)定吸光度，以葡萄糖溶液的濃度作為橫坐標(biāo)，以吸光度 A值為縱坐標(biāo)，做標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到回歸方程為Y=41.686X+0.42367（r=0.999），線性范圍為 0.005～0.03mg/ml。

表1 因素水平表

水平D提取次數(shù)（次）1 2 3 A加水量（倍）22 26 30 B提取時(shí)間（min）120 150 180 1 2 3

表2 L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

試驗(yàn)號(hào)1 2 3 4 5 6 7 8 9 K1 K2 K3 K1 K2 K3 R A 1 1 1 2 2 2 3 3 3 B 1 2 3 1 2 3 1 2 3 C 1 2 3 2 3 1 3 1 2 D 1 2 3 3 1 2 2 3 1多糖生藥含量（mg/g）3.03 2.51 3.24 2.41 1.84 1.99 2.34 2.64 2.72 8.78 6.24 7.70 2.93 2.08 2.57 0.85 7.78 6.99 7.95 2.59 2.33 2.65 0.32 7.66 7.64 7.42 2.55 2.55 2.47 0.07 7.59 6.84 8.29 2.53 2.28 2.76 0.48

表3 表3方差分析結(jié)果

方差來(lái)源F自由度P A B D誤差離差平方和1.083 0.175 0.351 0.012 2 2 2 2均方0.542 0.087 0.175 0.006 91.632 14.799 29.652＜0.05＞0.05＞0.05

3.2 靈芝多糖供試液的制備 不同工藝條件下水提取液濃縮，干燥，得干浸膏，精密稱(chēng)取0.05g，加水定容至100ml。其中多糖生藥含量是指：1g靈芝藥材里含有的多糖量。即浸膏里多糖的含量×干膏率

3.3 試劑配制 硫酸蒽酮溶液制備方法：稱(chēng)取蒽酮0.1g加入80%硫酸溶液100ml使溶解，搖勻。對(duì)照品溶液制備方法：精密稱(chēng)取無(wú)水葡萄糖對(duì)照品10mg，加水使溶解，定容至100ml，搖勻，制成濃度為0.1mg/ml葡萄糖對(duì)照品溶液。

3.4 方法學(xué)考察

3.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。分別精密吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2ml濃度為0.1mg/ml的葡萄糖對(duì)照品溶液置于10ml具塞試管中，分別加水到2ml，空白對(duì)照加水2ml，依次精密加入硫酸蒽酮溶液6ml，搖勻后置于水浴中加熱15min，取出，放入冷水浴中冷卻15min，以相應(yīng)的試劑為空白，在625nm處檢測(cè)，以葡萄糖濃度作為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程為A=32.543C+0.1949（r=0.999），線性范圍為 0.0025～0.0175mg/ml。見(jiàn)圖 1。

言語(yǔ)就擱在那兒進(jìn)行不下去了。馮一余尷尬地蹭了一會(huì)兒，又說(shuō)，其實(shí)，其實(shí)這也不能算是雇用什么的，其實(shí)這也是互相幫助嘛。老人互相看看，沒(méi)有再搭理他。其中一個(gè)說(shuō)，差不多了，回家煮晚飯了。一個(gè)個(gè)都站了起來(lái)，走了，把馮一余一個(gè)人扔在那里。

3.4.2 精密度。精密量取葡萄糖對(duì)照品溶液0.4ml置于10ml具塞試管中，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下自加水至2ml起操作，連續(xù)測(cè)定6次考察儀器精密度。RSD=0.16%，儀器精密度良好。

我又連著喝了幾大碗水，把嗓子里的藥片慢慢泡小一點(diǎn)然后咽了下去，這時(shí)突然發(fā)現(xiàn)藥瓶上寫(xiě)著三個(gè)大字——咀嚼片！

3.4.3 重復(fù)性。稱(chēng)取同一批次靈芝浸膏粉5份，按照2.1項(xiàng)下“樣品制備”方法和樣品含量測(cè)定方法進(jìn)行操作，考察操作方法的重現(xiàn)性。RSD=1.36%，重復(fù)性良好。3.4.4 穩(wěn)定性。取0.01mg/ml的葡萄糖溶液1.0ml置于10ml具塞試管中，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下自“加水至2ml”起操作。分別在 0、10、20、30、40、50、60、90、120 和 150分鐘處測(cè)定吸光度A。見(jiàn)表4。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

表4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

時(shí)間（min）多糖生藥含量（mg/g）3.19 010 3.26 20 3.17 30 3.22 40 3.26 50 3.16 60 3.23 90 3.24 120 3.27 150 3.25

3.4.5 加樣回收率。取已知含量的同一編號(hào)樣品粉末約0.025g，精密稱(chēng)定，加入相應(yīng)量的葡萄糖對(duì)照品溶液，依法測(cè)定，根據(jù)色譜峰峰面積值，計(jì)算回收率，得RSD=0.44%。見(jiàn)表5。結(jié)果表明，本法回收率好。

3.4.6 樣品含量測(cè)定。取3批靈芝，按照2.1項(xiàng)下“樣品制備”方法制備樣品溶液。取2ml樣品溶液按照標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下自“精密加入硫酸蒽酮溶液6ml”起操作，由回歸方程計(jì)算，即得樣品含量。見(jiàn)表6。

從IR譜圖可知，在3376cm-1左右出現(xiàn)了彎曲較弱單振動(dòng)吸收峰，在1395 cm-1處有較窄的吸收峰，可確證分子中存在胺結(jié)構(gòu)；3100～3000cm-1為=C-H的伸縮振動(dòng)峰；2922cm-1左右為-CH2反對(duì)稱(chēng)伸展振動(dòng)峰，1463cm-1左右為-CH2前剪式振動(dòng)峰或-CH3反對(duì)稱(chēng)振動(dòng)峰，故可確證有亞甲基結(jié)構(gòu)的存在；在1640cm-1左右出現(xiàn)了C=C基團(tuán)的強(qiáng)特征峰。

表5 回收率測(cè)定結(jié)果

組分 加入量（mg/g）平均回收率（%）RSD（%）靈芝多糖樣品稱(chēng)重（g）0.0247 0.0249 0.0251 0.025 0.0256 0.0254 0.0255 0.0252 0.0258多糖生藥含量（mg/g）3.20 3.22 3.23 3.24 3.30 3.26 3.28 3.25 3.31 2.60 3.2598.320.44 3.90測(cè)得量（mg/g）5.72 5.75 5.76 6.37 6.40 6.42 7.01 7.03 7.08 0.718 0.092回收率（%）98.6207 98.7973 98.7993 98.1510 97.7099 98.6175 97.6323 98.3217 98.1969

表6 樣品含量測(cè)定結(jié)果

樣品批號(hào)20160325 20160411 20160425多糖生藥含量（mg/g）3.19 3.25 3.22 RSD（%）0.93

4 討論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)考察了靈芝多糖提取的總加水量（22、26、30倍）、總提取時(shí)間（120、150、180min）及提取次數(shù)（1、2、3），由方差分析得到提取時(shí)間對(duì)靈芝多糖的影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。為了縮短生產(chǎn)周期，降低生產(chǎn)成本，確定提取時(shí)間為120分鐘。得到最佳提取條件為A1B1D3，即以12、9、9倍水提取三次，每次40min。

通過(guò)紫外-可見(jiàn)分光光度法對(duì)靈芝多糖樣品在190～800nm之間進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，當(dāng)吸收波長(zhǎng)在625nm時(shí)，樣品溶液的吸光度最大在用硫酸-蒽酮法測(cè)定多糖時(shí)，考察了顯色溫度（30、50、70、80、100℃），顯色時(shí)間（10、15、20、25、30min），隨著顯色溫度的升高，吸光度值增大，在70℃時(shí)吸光度值達(dá)到最大；顯色時(shí)間在15min時(shí)，吸光度最大，隨著顯色時(shí)間的延長(zhǎng)，吸光度變化不大，所以確定多糖的最佳檢測(cè)波長(zhǎng)為625nm，最佳顯色時(shí)間為15min。

多糖在自然界來(lái)源廣泛，毒副作用小，近年來(lái)中藥多糖研究成為熱點(diǎn)，研究證明中藥多糖有調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、抗腫瘤和抗病毒等生物活性，對(duì)增強(qiáng)機(jī)體免疫有廣泛影響［4］。硫酸-蒽酮法已廣泛運(yùn)用于多糖含量測(cè)定，此方法方便快速、穩(wěn)定性與重現(xiàn)性良好［5-6］。靈芝含有多糖、三萜和甾醇等多種有效成分，用于抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫、抗心血管病等多種疾病的治療［7］?，F(xiàn)代研究表明，靈芝多糖有廣泛的免疫調(diào)節(jié)活性，能夠提高機(jī)體免疫活性，靈芝三萜類(lèi)化合物還具有抗HIV的作用。本實(shí)驗(yàn)采用蒽酮-硫酸法測(cè)定了靈芝多糖含量，為靈芝藥材質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

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