糧食是人類賴以生存和發(fā)展的物質(zhì)基礎(chǔ), 其安全生產(chǎn)關(guān)乎社會(huì)的穩(wěn)定及世界和平與發(fā)展。水稻(Oryza sativa)作為主要的糧食作物, 為世界約一半人口提供主食, 但病害(稻瘟病和紋枯病)等因素長(zhǎng)期威脅著水稻的產(chǎn)量和品質(zhì), 給糧食生產(chǎn)帶來(lái)巨大損失, 嚴(yán)重制約了水稻生產(chǎn)(Dean et al., 2012; Li et al., 2019; 高杜娟等, 2019)。稻瘟病被稱為“水稻癌癥”, 在我國(guó)水稻栽培區(qū)域常年爆發(fā), 2013–2017年的年均危害面積高達(dá)7.5×107 hm2, 使水稻減產(chǎn)10%–30%, 有的地區(qū)甚至絕收(曹妮等, 2019; 楊德衛(wèi)等, 2019)。紋枯病一般情況下可使水稻減產(chǎn)10%–30%, 嚴(yán)重時(shí)超過(guò)50% (Zheng et al., 2013)。近年來(lái), 隨著秸稈還田和高密栽插等栽培管理技術(shù)的推廣, 田間紋枯病菌基數(shù)不斷富積, 造成其發(fā)生與危害日趨加重(Wang et al., 2015)。稻瘟病和紋枯病均屬于真菌病害。稻瘟病由子囊菌稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)引起, 在水稻各生育期和不同部位均可發(fā)生, 其中以葉瘟和穗頸瘟最為常見(jiàn)。稻瘟病菌以菌絲體或分生孢子形式在病谷或病稻草上越冬, 作為下一年的侵染源。其侵染過(guò)程包括分生孢子黏附寄主表皮、萌發(fā)產(chǎn)生芽管、芽管末端分化形成附著胞、侵染釘刺穿寄主表皮、侵染菌絲增殖并殺傷植物組織和產(chǎn)孢及釋放侵染單元等(Wilson and Talbot, 2009; 許有嬪等, 2017)。紋枯病致病菌為立枯絲核菌(Rhizoctonia solani), 該菌以菌核或病殘?bào)w在土壤中越冬。環(huán)境條件適宜時(shí), 菌核萌發(fā)出菌絲侵染水稻基部葉鞘, 并以菌絲體向植株上部葉鞘等其它部位擴(kuò)展, 造成葉鞘葉片壞死。分蘗期通常是紋枯病發(fā)生和橫向傳播的重要階段; 孕穗至籽粒灌漿中期則是紋枯病縱向擴(kuò)展和造成重要經(jīng)濟(jì)損失的關(guān)鍵時(shí)期(左示敏等, 2010)。 實(shí)踐證明, 挖掘水稻抗病資源并在育種中加以利用, 是控制病害流行和危害最經(jīng)濟(jì)有效的措施。長(zhǎng)期以來(lái), 育種家們投入了大量時(shí)間和精力, 從自然寶庫(kù)中挖掘優(yōu)異的抗病資源, 并將其應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐?？共⌒澡b定上, 傳統(tǒng)策略主要是在病害高發(fā)區(qū)進(jìn)行自然鑒定。然而, 由于病害的自發(fā)程度受地理環(huán)境和氣候條件限制, 加之病原菌高度變異, 流行的優(yōu)勢(shì)生理小種頻繁更迭, 導(dǎo)致病害高發(fā)區(qū)的抗病性鑒定具有不可控性。此外, 育種基地一般遠(yuǎn)離病害高發(fā)區(qū), 致使抗病性鑒定往往耗時(shí)費(fèi)力, 因而抗病育種在實(shí)際操作中難以有效開(kāi)展(陳錦文等, 2015)。為滿足水稻抗病理論和應(yīng)用研究的現(xiàn)實(shí)需求, 以及推廣可控性好、一致性強(qiáng)并便于廣泛應(yīng)用的病害抗性鑒定方法, 我們?cè)斒隽怂镜疚敛『图y枯病的人工接種鑒定方法與流程, 供同行參考。1 實(shí)驗(yàn)材料稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae B.C. Couch)為標(biāo)準(zhǔn)菌株Guy11, 紋枯病菌(RhizoctoniasolaniKühn)菌株為中強(qiáng)致病菌株YN-7; 水稻(Oryza sativa L.)材料為稻瘟病易感品種麗江新團(tuán)黑谷和紋枯病易感品種Lemont。2 試劑●番茄燕麥培養(yǎng)基(oat tomato agar, OTA): 新鮮番茄(fresh tomato)和市售燕麥片(oatmeal)。● BD試劑: 馬鈴薯葡萄糖肉湯(potato dextrosebro-th, Cat No.M305-02)。● Sigma試劑: 6-芐氨基嘌呤(6-benzylaminopurine, Cat No.B3408)。●生工生物試劑: 蛋白胨(peptone, Cat No.A50-5247)、酵母提取物(yeast extract, Cat No.A515-245)、酪蛋白水解物(casamino acids, Cat No.A10-0851)、葡萄糖(glucose, Cat No.A610219)、氯7H2O, Cat No. A6-1-0329)、磷酸二氫鉀(KH2PO4, Cat No.A501211)、生物素(biotin, Cat No.A100340)、維生素B1 (thia-mine, Cat No.A500986)、維生素B6 (pyridoxin, Cat No.A600797)、維生素B2 (riboflavin, Cat No.A6-00-470)、對(duì)氨基苯甲酸(p-aminobenzoic acid, Cat No.A500-039)、煙酸(nicotinic acid, Cat No.A610-660)、硫酸鋅七水(ZnSO4·7H2O, Cat No.A60206)、硼酸(H3BO3, Cat No.A100588)、氯化錳四水(MnCl2·4H2O, Cat No.A500331)、硫酸亞鐵七水(FeSO4·7H2O, Cat No.A501386)、氯化鈷六水H2O, Cat No.A100330)、鉬酸鈉二水(Na2MoO4·2H2O, Cat No.A610358)、瓊脂粉(agar, Cat No.A100637)以及吐溫20 (Tween-20, Cat No.A100777)。● 麥克林試劑: 硝酸鈉(NaNO3, Cat No.S817996)。3 試劑配方本實(shí)驗(yàn)所用試劑配方見(jiàn)表1。表1 稻瘟病菌和紋枯病菌生長(zhǎng)培養(yǎng)所需相關(guān)試劑配方4 儀器設(shè)備●常用設(shè)備及設(shè)施: 恒溫光照培養(yǎng)箱、高溫高壓滅菌鍋、超凈工作臺(tái)、顯微鏡、噴霧加濕器和人工氣候室。●通用耗材: 無(wú)菌培養(yǎng)皿、鑷子、解剖刀、噴霧瓶、打孔器、濕度計(jì)、玻璃錐形瓶、移液器、血球計(jì)數(shù)板、注射器、離心管、擦鏡紙、醫(yī)用棉簽、醫(yī)用紗布、阿尤斯木制0.8 mm厚豎紋木皮和花盆(65 cm (長(zhǎng))× 23 cm (寬)×18 cm (高))。●離體莖稈紋枯病菌接種鑒定室的搭建: 在離體莖稈紋枯病抗性鑒定過(guò)程中, 需搭建1個(gè)接種鑒定室,該室由鋁合金型材框架、保濕托盤和聚酯薄膜組成?？蚣艿拈L(zhǎng)、寬、高為800 mm×400 mm×800 mm, 由橫截面20 mm×20 mm的鋁合金柱拼接而成?？蚣艿膫?cè)面及頂面覆以聚酯薄膜(可用膠帶固定, 但不能完全密封); 將搭建好的框架置于水深約7 cm的托盤內(nèi), 托盤的長(zhǎng)、寬、高為925 mm×625 mm×140 mm。莖稈培養(yǎng)架包括長(zhǎng)、寬、高為340 mm×270 mm× 130 mm的塑料盒、孔徑為15 mm的試管架、花泥和營(yíng)養(yǎng)液; 花泥使用前需用清水浸泡24小時(shí), 營(yíng)養(yǎng)液配制參照文獻(xiàn)(Yoshida et al., 1976)所述配方。5 實(shí)驗(yàn)方法5.1 水稻幼苗期噴霧接種的稻瘟病抗性鑒定幼苗期噴霧接種法是目前鑒定稻瘟病抗性最為常用的方法, 其優(yōu)點(diǎn)是通過(guò)培養(yǎng)稻瘟病菌進(jìn)行接種, 可最大限度地避免田間自發(fā)病害的不可控性, 而且通過(guò)使用不同的水稻品種及稻瘟病菌生理小種, 可快速且準(zhǔn)確地鑒定不同水稻品種的抗譜。(1) 準(zhǔn)備水稻幼苗期材料: 在平整的田間育秧土地上, 劃分長(zhǎng)、寬為50 cm×5 cm的種植小區(qū), 每個(gè)小區(qū)播種30–50粒催芽處理的水稻種子(圖1A), 用透明薄膜覆蓋保溫。生長(zhǎng)14天至四葉期用于接種稻瘟病菌(圖1B)。(2) 活化菌株: 將保存的濾紙片平鋪于CM培養(yǎng)基中央, 25°C光照培養(yǎng)5–7天后, 從菌落邊緣切取直徑0.5 cm的菌絲塊, 接種于新的CM培養(yǎng)基上, 25°C培養(yǎng)(圖1C)。(3) 準(zhǔn)備產(chǎn)孢平板: 待CM培養(yǎng)基上的稻瘟病菌菌落生長(zhǎng)至接近滿皿時(shí)(約7天), 加入3–5 mL無(wú)菌水,用涂布棒將菌絲打斷成細(xì)小碎段, 吸取菌液, 轉(zhuǎn)移至直徑9 cm的番茄燕麥產(chǎn)孢平板, 涂布均勻晾干, 25°C光照培養(yǎng)2天。(4) 產(chǎn)孢: 用棉簽擦除培養(yǎng)基表面的氣生菌絲, 然后用無(wú)菌水沖洗晾干, 最后用雙層紗布封蓋培養(yǎng)皿, 25°C光照培養(yǎng)2–3天(圖1D)。(5) 制備孢懸液: 每皿加入5 mL滅菌水, 洗下培養(yǎng)基表面的分生孢子, 過(guò)濾收集孢懸液。混勻后測(cè)定孢子濃度, 并將孢懸液濃度調(diào)至105個(gè)·mL?1。圖1 水稻幼苗期接種稻瘟病菌進(jìn)行抗性鑒定及典型病斑(A) 苗床上分小區(qū)播種水稻種子; (B) 生長(zhǎng)2周的幼苗期水稻; (C) CM平板上的稻瘟病菌菌落; (D) 番茄燕麥產(chǎn)孢平板上生長(zhǎng)的稻瘟病菌; (E) 對(duì)水稻小區(qū)噴霧接種孢懸液; (F) 接種6天后稻瘟病的發(fā)病情況; (G) 水稻葉片上產(chǎn)生的典型紡錘形病斑(Bar=1 cm)。(6) 田間噴霧接種: 將孢懸液轉(zhuǎn)移至噴霧瓶中, 加入Tween-20至終濃度0.01%, 然后噴霧接種于田間生長(zhǎng)約14天的水稻幼苗(圖1E)。(7) 抗感性鑒別: 接種后5–7天開(kāi)始發(fā)病(圖1F), 參照“水稻品種試驗(yàn)稻瘟病抗性鑒定與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)程”(中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T2646-2014)中所述的苗瘟調(diào)查分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)(表2), 評(píng)價(jià)水稻的抗感性。感病水稻材料被稻瘟病菌侵染后, 產(chǎn)生典型的紡錘形病斑(圖1G), 病斑中央呈灰色, 生長(zhǎng)有菌絲和分生孢子, 中央外圍有褐色壞死, 病斑最外層為淡黃色的中毒部位; 抗病材料在侵染后, 免疫系統(tǒng)被激活而產(chǎn)生超敏反應(yīng), 誘發(fā)自發(fā)性細(xì)胞死亡, 無(wú)病斑產(chǎn)生或僅產(chǎn)生針頭狀褐點(diǎn)。表2 水稻幼苗期葉瘟調(diào)查的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)表3 水稻穗頸瘟單穗損失率分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)(1) 控制好稻瘟病菌的生長(zhǎng)和產(chǎn)孢條件。在直徑9 cm的CM培養(yǎng)基平皿中, 稻瘟病菌最適生長(zhǎng)天數(shù)約為7天, 時(shí)間過(guò)長(zhǎng)容易老化失活。使用番茄燕麥培養(yǎng)基產(chǎn)孢時(shí), 需用紗布蓋住平皿, 以利于通氣和光照進(jìn)而促進(jìn)產(chǎn)孢。(2) 根據(jù)接種水稻材料的數(shù)量確定番茄燕麥產(chǎn)孢平板的使用量。通常每個(gè)直徑9 cm的產(chǎn)孢培養(yǎng)基產(chǎn)生的孢子量, 可制備約50–100 mL的105個(gè)·mL?1孢懸液, 供約10–20個(gè)水稻種植小區(qū)噴霧接種。(3) 稻瘟病菌孢懸液需現(xiàn)配現(xiàn)用。稻瘟病菌孢懸液配制好后, 需在2小時(shí)內(nèi)使用, 以避免放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)而失活。(4) 稻瘟病田間接種時(shí)需避免日照和注意保溫。接種常在下午日落時(shí)或之后進(jìn)行, 以避免陽(yáng)光紫外線對(duì)稻瘟病菌造成傷害, 接種完成后用薄膜覆蓋苗床過(guò)夜。5.2 水稻分蘗期和孕穗期注射接種的稻瘟病抗性鑒定水稻分蘗成熟階段的葉片發(fā)病稱為葉瘟, 一般在水稻分蘗盛期后產(chǎn)生, 嚴(yán)重時(shí)病斑密布且葉片枯焦,甚至出現(xiàn)植株枯死。穗頸瘟發(fā)生在抽穗破口前, 水稻穗軸與稻穗的連接處, 常使穗頸節(jié)壞死, 形成癟?；虬姿?。育種實(shí)踐中常通過(guò)聚合抗病基因來(lái)改良葉瘟和穗頸瘟抗性, 而采用有效的分蘗期和孕穗期抗性鑒定方法, 是實(shí)現(xiàn)抗病基因有效聚合和增強(qiáng)抗性的關(guān)鍵。(1) 種植水稻材料: 按照5.1.1節(jié)所述方法準(zhǔn)備水稻幼苗期材料。將苗床上生長(zhǎng)1個(gè)月的秧苗移栽, 按每小區(qū)2行、每行12株移栽大田, 常規(guī)水肥管理。待水稻生長(zhǎng)至分蘗盛期時(shí)進(jìn)行注射接種, 以鑒定葉瘟; 待水稻生長(zhǎng)至孕穗期時(shí)接種, 以鑒定穗頸瘟。(2) 準(zhǔn)備稻瘟病菌接種物: 按照5.1.1節(jié)所述方法培養(yǎng)稻瘟病菌, 并制備濃度為105個(gè)·mL?1的稻瘟病菌孢懸液。(3) 注射接種: 用注射器將孢懸液緩慢注入分蘗盛期水稻植株莖稈的葉鞘(圖2A), 每小區(qū)接種單行12株, 每株接種3個(gè)分蘗的莖稈, 每莖稈注射約1 mL孢懸液; 處于孕穗期的水稻植株, 注射方法為在距離水稻莖稈頂端約5–10 cm處, 將孢懸液注入稻莖中央部位(圖3A), 直至心葉滲出孢懸液。
(4) 觀察病情: 感病品種在分蘗盛期注射接種后約7天出現(xiàn)葉瘟(圖2B), 而孕穗期注射接種后, 在稻穗灌漿成熟時(shí)產(chǎn)生穗頸瘟(圖3B)。參照“水稻品種試驗(yàn)稻瘟病抗性鑒定與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)程”的九級(jí)標(biāo)準(zhǔn)(表2)鑒定葉瘟發(fā)病程度, 根據(jù)穗頸瘟單穗損失率分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)(表3)鑒定穗頸瘟的發(fā)病程度。(A) 分蘗盛期注射接種葉鞘; (B) 葉瘟病斑。(A) 水稻孕穗期注射接種; (B) 穗頸瘟病狀。(1) 把握準(zhǔn)確的接種時(shí)期。由于水稻稻瘟病注射接種通常在分蘗盛期或孕穗期進(jìn)行, 因此需根據(jù)水稻生育期, 計(jì)劃好接種時(shí)間。(2) 水稻田間管理避免使用稻瘟病農(nóng)藥。為防止因使用殺真菌農(nóng)藥干擾抗性鑒定結(jié)果, 水稻種植期間應(yīng)避免噴施稻瘟病防治農(nóng)藥。5.3 水稻離體葉片戳傷接種的稻瘟病抗性鑒定稻瘟病菌侵染水稻時(shí), 需突破水稻的表皮物理屏障才能順利進(jìn)入寄主組織定殖。由于不同水稻品種表皮的機(jī)械強(qiáng)度各異, 故在抵御稻瘟病菌刺破表皮的能力方面存在差異, 導(dǎo)致抗性基因所介導(dǎo)的抗病表型鑒定不準(zhǔn)確。水稻葉片戳傷接種法中, 稻瘟病菌不必刺破表性。(1) 配置6-芐氨基嘌呤水溶液: 配置pH7.0的10 μg·- mL–1 6-芐氨基嘌呤溶液, 分裝至直徑9 cm無(wú)菌培養(yǎng)皿, 每皿約30 mL。
(2) 準(zhǔn)備水稻離體葉片: 選取生長(zhǎng)至四葉期的水稻幼苗, 從幼苗同一部位剪取長(zhǎng)6 cm的葉段, 使用10 μL的槍頭輕輕戳點(diǎn)葉片, 每隔1.5 cm戳點(diǎn)1次, 每片葉上形成3個(gè)表皮傷口(圖4A)。然后將葉片放入平皿, 使其漂浮于6-芐氨基嘌呤水溶液的表面, 每皿放置6–8片戳傷葉片(圖4B)。
(3) 制備孢懸液: 參照5.1.1節(jié)所述流程制備稻瘟病菌孢懸液, 調(diào)整孢懸液濃度至105個(gè)·mL?1, 備用。(4) 孢懸液點(diǎn)滴接種葉片: 用10 μL的移液器取5 μL配制好的孢懸液, 滴至葉片的戳傷處(圖4C, D)。接種完畢后蓋上平皿蓋, 置于25°C恒溫光照培養(yǎng)箱。(5) 觀察發(fā)病情況: 接種當(dāng)天用黑布遮蓋平皿, 第2天移去黑布, 在25°C下14小時(shí)光照/10小時(shí)黑暗放置4–5天。(6) 抗感性鑒別: 詳見(jiàn)5.1.1節(jié)所述, 典型稻瘟病病斑呈紡錘形, 病斑中央呈灰色, 中央外圍有褐色壞死, 最外層為淡黃色(圖4E)。以褐色壞死為邊界, 測(cè)量病斑長(zhǎng)度, 統(tǒng)計(jì)20個(gè)以上病斑長(zhǎng)度的平均值, 作為水稻抗感性指標(biāo)。圖4 水稻離體葉片的點(diǎn)滴接種及稻瘟病病斑(A) 采用10 μL移液器槍頭對(duì)標(biāo)1.5 cm的刻度戳傷水稻葉片; (B) 戳傷之后漂浮于平皿6-BA溶液中的水稻葉片; (C) 對(duì)戳傷葉片進(jìn)行點(diǎn)滴接種; (D) 點(diǎn)滴接種之后的水稻葉片; (E) 水稻葉片上的病斑(Bar=1 cm)。(1) 待測(cè)水稻葉片的來(lái)源部位需保持一致。為保證水稻葉片幼嫩程度一致和稻瘟病發(fā)病程度均一, 應(yīng)剪取水稻植株同一部位的葉片(倒二葉較為合適)。(2) 戳傷時(shí)避免刺穿水稻葉片。由于水稻四葉期的葉片較為幼嫩, 需控制戳傷力度, 防止水稻葉片被刺穿進(jìn)而導(dǎo)致孢懸液在傷口處滴漏。5.4 水稻分蘗期紋枯病田間接種鑒定田間自然條件下, 水稻紋枯病的第一危害高峰通常發(fā)生在分蘗末期, 以侵染基部葉鞘為主。為避免病害自然發(fā)生的不均衡性影響抗性鑒定結(jié)果, 在田間進(jìn)行紋枯病菌人工接種鑒定時(shí), 需在分蘗末期前完成接種。此外, 考慮到田間鑒定主要是面向?qū)嶋H應(yīng)用, 病害調(diào)查一般在抽穗后約30天病情穩(wěn)定時(shí)進(jìn)行。該方法主要適用于生育期相對(duì)集中、株高差異不太大, 且對(duì)育種應(yīng)用價(jià)值評(píng)價(jià)要求高的水稻材料。(1) 種植水稻材料: 每份水稻材料設(shè)置不低于3次重復(fù), 每個(gè)重復(fù)種植3行, 每行不低于12株, 中間行的中間10株或以上用于接種; 常規(guī)病蟲害管理, 但不施用廣譜抗真菌藥劑; 分蘗期至孕穗期的氮肥施用量可比正常水稻田多20%。(2) 培養(yǎng)紋枯病菌: 將紋枯病菌菌塊接種于PDA培養(yǎng)基, 28°C黑暗下培養(yǎng)2–3天后, 將1塊活化的菌塊傳代至新的PDA培養(yǎng)基, 28°C黑暗下培養(yǎng)2天。(3) 制備紋枯病菌木皮接種物: 將0.8 mm厚的木皮(圖5A)剪為長(zhǎng)1 cm、寬2 mm的木片, 放入直徑為9 cm的玻璃培養(yǎng)皿中(圖5B)。在滅菌后的培養(yǎng)皿內(nèi)加入6 mL PDB培養(yǎng)液浸沒(méi)木片; 挑取直徑為8 mm的菌塊, 置于皿中央; 用滅菌濕紗布蓋好培養(yǎng)皿, 28°C黑暗下培養(yǎng)3天, 待木片表面布滿菌絲, 即可用作接種物(圖5C)。(4) 紋枯菌接種及接種后的田間管理: 采用嵌入法接種, 于水稻分蘗末期前接種紋枯菌木片。用鑷子將木皮接種物嵌入水稻主莖稈自上而下第3葉葉枕下1 cm處的葉鞘(倒3葉鞘)內(nèi)側(cè)(圖5D)。此時(shí), 倒2葉葉鞘不再伸長(zhǎng), 木片接種物可固定于此。每株水稻接種3個(gè)主分蘗, 接種后田間保持2–5 cm淺水層(圖5E)。(5) 紋枯病抗性評(píng)價(jià): 于抽穗后約30天病情穩(wěn)定時(shí), 調(diào)查紋枯病的發(fā)病情況(圖5F, G)。采用表4所述病情評(píng)價(jià)指標(biāo), 對(duì)所有有效分蘗的莖稈病級(jí), 以病級(jí)和病情指數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)抗感差異。使用病級(jí)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)時(shí), 以每株中發(fā)病最重的3個(gè)莖稈病級(jí)的平均數(shù)表示相應(yīng)植株的病級(jí), 并進(jìn)一步計(jì)算獲得3個(gè)重復(fù)中累計(jì)30個(gè)植株的平均病級(jí), 來(lái)表示相應(yīng)品種/系的病級(jí)。以病情指數(shù)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)時(shí), 每株的病情指數(shù)按照公式(病情指數(shù)=(9n9 8n8 7n7 6n6 5n5 4n4 3n3 2n2 1n1 0n0)/9N×100)計(jì)算獲得。式中, n0–9是每種病級(jí)(1–9)的分蘗數(shù), N是每個(gè)植株調(diào)查的總分蘗數(shù); 進(jìn)而可計(jì)算獲得3個(gè)重復(fù)中累計(jì)30個(gè)植株的平均病情指數(shù), 以此表示相應(yīng)品種/系的病情指數(shù)。(A) 0.8 mm厚豎紋木皮; (B) 布滿紋枯菌菌絲的木皮接種物(以下簡(jiǎn)稱木皮接種物); (C) 木皮接種物表面菌絲的顯微觀測(cè); (D) 用鑷子將接種物嵌入自上而下第3葉鞘內(nèi)側(cè); (E) 水稻分蘗期田間人工接種; (F) 高感水稻品種Lemont接種后11天的病情擴(kuò)展情況; (G) 高感水稻品種Lemont抽穗后30天的病情擴(kuò)展情況。表4 田間紋枯病病級(jí)的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)(1) 準(zhǔn)備紋枯病菌時(shí), PDB培養(yǎng)液不宜漫過(guò)木片太多, 否則菌絲不易附著于木片表面。夾取木片進(jìn)行接種時(shí), 應(yīng)注意不要黏帶過(guò)多木片四周的菌絲或培養(yǎng)基。(2) 注意合適的水稻田間管理。考慮到田間影響發(fā)病程度的因素復(fù)雜, 田間鑒定時(shí)的生物學(xué)重復(fù)一般不低于3次; 種植管理過(guò)程中建議適當(dāng)密植, 在分蘗至孕穗期適當(dāng)增施氮肥, 接種前2天可以施1次氮肥, 促進(jìn)水稻營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)以利于發(fā)病; 病蟲害防治中需盡量避免使用廣譜抗真菌農(nóng)藥。(3) 把握準(zhǔn)確的接種時(shí)期和接種后管理。務(wù)必在分蘗末期前完成病原菌接種, 避免分蘗末期后田間的紋枯病自發(fā)量增加而影響人工接種效果。接種后田間應(yīng)長(zhǎng)期保持2 cm以上水層, 有利于保持田間高濕小氣候。(4) 本鑒定方法的優(yōu)勢(shì)是完全在自然條件下進(jìn)行, 鑒定結(jié)果貼近育種實(shí)際。缺點(diǎn)是須有足夠的試驗(yàn)田,工作量大、周期長(zhǎng), 且難以排除生育期和株型對(duì)紋枯病抗性的影響。5.5 水稻孕穗期溫室接種的紋枯病抗性鑒定孕穗至灌漿中期通常是水稻紋枯病嚴(yán)重發(fā)生的第二個(gè)關(guān)鍵時(shí)期, 也是對(duì)產(chǎn)量和品質(zhì)影響最重要的生育階段。因此, 對(duì)這一生育期的水稻材料進(jìn)行溫室抗性鑒定具有極其重要的意義。在溫室進(jìn)行接種鑒定, 有利于排除環(huán)境因素的干擾, 較精準(zhǔn)地鑒別各材料的抗性差異。該方法鑒定結(jié)果重復(fù)性好且可靠性高, 適于對(duì)表型鑒定精度要求高的各類試驗(yàn)。(1) 水稻材料的準(zhǔn)備: 將水稻種子播種在裝有營(yíng)養(yǎng)土的長(zhǎng)條形花盆(土面距盆頂約2–3 cm)中, 每盆4株, 在自然光照下培養(yǎng)至孕穗初期, 期間常規(guī)水肥管理, 確保每株均能產(chǎn)生足夠的分蘗(一般要求每株不低于4個(gè)主分蘗) (圖6A)。每份材料接種鑒定株數(shù)不低于6株, 可分設(shè)3個(gè)重復(fù)進(jìn)行; 每株接種不低于3個(gè)莖稈。接種前10天不施真菌殺菌劑, 接種前2天增施適量氮肥并轉(zhuǎn)移至溫室進(jìn)行適應(yīng)性培養(yǎng)。接種前適當(dāng)剪除植株基部的枯爛葉, 如小分蘗過(guò)多, 可用剪刀從基部剪除。(2) 紋枯菌接種物的準(zhǔn)備: 參照5.4.1節(jié)所述方法準(zhǔn)備紋枯病菌木皮接種物。
(3) 接種及接種后管理: 采用嵌入法接種, 用鑷子將培養(yǎng)好的紋枯病菌木皮接種物放入自上而下第3葉葉枕下1 cm的葉鞘內(nèi)側(cè)(圖6B), 確保接種后葉鞘的抱莖狀態(tài)不變。接種后保證花盆中有不低于1 cm的水層, 將溫室內(nèi)溫光條件設(shè)置為30°C下14小時(shí)光照/10小時(shí)黑暗(24°C), 利用噴霧加濕裝置將溫室濕度控制在75%–90% (圖6C)。(4) 紋枯病病情調(diào)查: 接種后14或21天出現(xiàn)明顯的紋枯病病斑(圖6D), 此時(shí)測(cè)量水稻劍葉葉枕至植株基部間的葉鞘長(zhǎng)度(葉鞘總長(zhǎng)度), 以及葉鞘上病斑最高點(diǎn)至最低點(diǎn)的長(zhǎng)度(病斑長(zhǎng)度), 用于計(jì)算平均相對(duì)病斑長(zhǎng)度=(病斑長(zhǎng)度×100%)/葉鞘總長(zhǎng)度。按照表5所示的相對(duì)病斑長(zhǎng)度標(biāo)準(zhǔn)(或通過(guò)估算病斑面積占葉鞘總面積的比例), 判斷材料間的紋枯病抗性差異。(A) 生長(zhǎng)于花盆中的孕穗期水稻植株; (B) 對(duì)孕穗期水稻的葉鞘接種紋枯病菌木皮; (C) 接種后置于溫室中的水稻植株; (D) 感病品種接種21天后的紋枯病病狀。(1) 培養(yǎng)壯苗是開(kāi)展紋枯病溫室精準(zhǔn)鑒定的前提。選擇種植培養(yǎng)水稻材料的花盆時(shí), 盡可能選擇深度不低于18 cm且寬度不低于23 cm的長(zhǎng)條形花盆。培養(yǎng)盆中裝入足夠的土壤, 表面用無(wú)菌土覆蓋。
(2) 選擇恰當(dāng)?shù)牟∏檎{(diào)查時(shí)間?？筛鶕?jù)鑒定材料的具體抗性情況, 選擇感病材料病斑最先擴(kuò)展至劍葉枕時(shí)為病情調(diào)查的時(shí)間點(diǎn)。5.6 水稻離體莖稈紋枯病的抗性鑒定相比于水稻分蘗期田間接種和孕穗期溫室接種的抗病性鑒定方法, 離體莖稈接種鑒定法具有通量高和周期短的優(yōu)勢(shì), 能有效避免生育期和株型這兩個(gè)顯著影響紋枯病抗性的干擾, 可用于大量水稻自然種質(zhì)資源的紋枯病抗性初步評(píng)價(jià)。(1) 紋枯病菌木皮接種物的準(zhǔn)備: 參照5.4.1節(jié)所述方法準(zhǔn)備紋枯病菌接種物。(2) 搭建接種室: 在溫光可控的人工氣候室內(nèi), 搭建能保濕的接種室(圖7A)。(3) 種植水稻材料: 在大田正常溫光條件下培育水稻, 確保植株健康。孕穗期選取長(zhǎng)短一致且具有完全倒二葉葉鞘的主分蘗莖稈, 從倒二葉葉鞘基部莖節(jié)下方1 cm處剪斷莖稈, 去除葉片,保留倒一、倒二葉葉鞘和莖節(jié)。將莖稈浸水并放置于接種室中預(yù)培養(yǎng)24小時(shí), 然后插入裝有花泥的莖稈培養(yǎng)架。(4) 接種及接種后管理: 采用嵌入法接種, 將培養(yǎng)好的木皮接種物放入葉枕下0.5 cm處的葉鞘內(nèi)側(cè),接種后將莖稈培養(yǎng)架置于接種室的框架內(nèi), 使整個(gè)接種培養(yǎng)裝置位于盛水托盤內(nèi)(圖7B)。人工氣候室的溫光條件為30°C下14小時(shí)光照/10小時(shí)黑暗, 并通過(guò)加濕器和覆蓋聚酯薄膜, 保證接種室內(nèi)的濕度維持在75%–95% (圖7C)。(5) 病情調(diào)查: 密切觀察病斑的發(fā)展情況(圖7D)。當(dāng)感病材料的病斑距試管架上表面約1 cm時(shí)(圖7E), 測(cè)量各材料的葉鞘長(zhǎng)度及其上的病斑長(zhǎng)度。按照5.5.1節(jié)所述方法, 計(jì)算相對(duì)病斑長(zhǎng)度, 并基于相對(duì)病斑長(zhǎng)度劃分水稻材料的紋枯病抗感強(qiáng)弱和類別(表5)。(A) 接種框架; (B) 使用嵌入法進(jìn)行木皮接種物接種; (C) 接種后的培養(yǎng)室; (D) 高感品種Lemont接種后3天病斑的擴(kuò)展情況; (E) Lemont接種7天后病斑的擴(kuò)展情況。表5 離體莖稈接種鑒定法的紋枯病抗感分類標(biāo)準(zhǔn)(1) 為確保莖稈的植株健康, 建議在大田自然條件下培育水稻, 并注意病蟲害防治。為防止取樣后的離體莖稈失水萎蔫, 最好在傍晚剪取莖稈, 并將葉片修剪至約2 cm長(zhǎng), 處理好的莖稈應(yīng)立即放入水杯中, 創(chuàng)口不宜連續(xù)暴露空氣中超過(guò)10分鐘; 固定莖稈的花泥須提前用清水浸泡24小時(shí), 期間換水3–4次。(2) 做好接種和接種后管理。確保接種葉鞘的抱莖狀態(tài)不變, 利用葉鞘自身的緊密包裹, 保證接種物上的菌絲不至于失水枯死。接種室覆蓋的聚酯薄膜不能完全封閉, 要適當(dāng)保持空氣流通, 使接種室溫度與人工氣候室相當(dāng)。(3) 計(jì)劃好鑒定水稻材料的數(shù)量。評(píng)定1份材料的抗性應(yīng)接種不低于10個(gè)莖稈, 并設(shè)置3個(gè)重復(fù)。在1個(gè)12 m2的人工氣候室內(nèi)可以布置8個(gè)接種室, 每個(gè)接種室可放置4個(gè)塑料培養(yǎng)架, 每個(gè)培養(yǎng)架內(nèi)可放置5個(gè)單排10孔的試管架, 1個(gè)鑒定周期為8–10天, 以每個(gè)材料10個(gè)莖稈計(jì)算, 1個(gè)月內(nèi)可完成約500份水稻材料的抗性鑒定。(4) 本鑒定方法適于在孕穗期接種, 孕穗期是紋枯病縱向傳播和造成水稻損失的關(guān)鍵階段。因此, 評(píng)價(jià)此時(shí)期離體莖稈的紋枯病抗性具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。但該法鑒定結(jié)果的分辨率低于水稻孕穗期溫室接種鑒定法, 不太適于鑒別微弱抗性差異的材料。
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