RNA干擾(RNA interference, RNAi)是抵御外源基因入侵的一種天然防御機(jī)制。包括小干擾RNA (siRNA)和microRNA (miRNA)在內(nèi)的RNAi形式能夠以一種序列特異性的方式、通過(guò)介導(dǎo)靶mRNA降解或抑制mRNA翻譯來(lái)敲低靶基因的表達(dá)。由于siRNA和miRNA之間的細(xì)微差異（一個(gè)miRNA可能同時(shí)影響幾個(gè)不同靶基因的表達(dá)），siRNA通常能夠比miRNA觸發(fā)更有效、更具特異性的基因沉默，因此，siRNA和miRNA在藥物實(shí)踐中有著不同的作用（圖1）。

自1998年RNAi概念確立以來(lái)[1]，siRNA療法經(jīng)歷了多次起起落落。2001年，Sayda M.Elbashir等通過(guò)將化學(xué)合成的siRNA引入哺乳動(dòng)物細(xì)胞，成功地沉默了一個(gè)特定基因的表達(dá)[2]。這一突破進(jìn)展導(dǎo)致了一波研發(fā)熱潮，到2003年，已有很多家公司布局RNAi療法。

不幸的是，第一次使用未經(jīng)修飾的siRNA進(jìn)行的臨床試驗(yàn)產(chǎn)生了與免疫相關(guān)的毒性，以及可疑（不確定）的RNAi效應(yīng)。第二波臨床試驗(yàn)使用了系統(tǒng)給藥的siRNA納米顆粒制劑，盡管取得了重要進(jìn)展（如，首次證實(shí)siRNA納米顆粒系統(tǒng)給藥可在人體內(nèi)產(chǎn)生RNAi效應(yīng)），但依然表現(xiàn)出了顯著的劑量限制毒性以及療效不足。這些研發(fā)中暴露的問(wèn)題使得大部分制藥公司在2010年代早期退出了RNAi領(lǐng)域。

不過(guò)，隨著科學(xué)家們?cè)诨瘜W(xué)修飾以及遞送方面不斷取得新的突破，RNAi療法逐漸又回到藥物研發(fā)的“中心”。2018年，該領(lǐng)域迎來(lái)了一個(gè)里程碑：美國(guó)FDA批準(zhǔn)了首個(gè)RNAi療法（ONPATTRO?）上市，用于治療遺傳性轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白淀粉樣變性（hATTR）引起的神經(jīng)損傷。2019年11月，F(xiàn)DA又批準(zhǔn)第二款RNAi療法GIVLAARI?用于治療急性肝性卟啉癥（acute hepatic porphyria, AHP）。

與小分子和單克隆抗體藥物相比，siRNA具有先天優(yōu)勢(shì)，因?yàn)閟iRNA通過(guò)與mRNA完成Watson–Crick堿基配對(duì)來(lái)實(shí)現(xiàn)其功能，而小分子和單克隆抗體藥物則需要識(shí)別某些蛋白質(zhì)復(fù)雜的空間構(gòu)象。有許多疾病無(wú)法通過(guò)小分子和單克隆抗體藥物治療，因?yàn)?，無(wú)法鑒定出針對(duì)致病蛋白的具有較高活性、親和力和特異性的分子。相反，從理論上講，siRNA可以靶向任何感興趣的基因，只需要選擇靶向mRNA上正確的核苷酸序列。這一優(yōu)勢(shì)使得siRNA比小分子或抗體藥物的研發(fā)周期更短，治療領(lǐng)域更廣。

不過(guò)，盡管siRNA在藥物開(kāi)發(fā)方面有著廣闊的前景，但細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的多重障礙限制了其廣泛的臨床應(yīng)用。比如，未經(jīng)修飾的siRNA具有穩(wěn)定性不理想、藥代動(dòng)力學(xué)特征較差、可能誘導(dǎo)脫靶效應(yīng)等缺點(diǎn)。此外，siRNA的磷酸二酯鍵易受RNases和磷酸酶的損傷。一旦通過(guò)系統(tǒng)給藥進(jìn)入循環(huán)，遍布全身的內(nèi)切酶或外切酶將迅速將siRNA降解為片段，阻止了完整的治療用siRNA在預(yù)期組織中積累。

另一方面，理論上，siRNA只有在其反義鏈與目標(biāo)mRNA完全堿基配對(duì)時(shí)才能發(fā)揮作用。然而，RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)可以耐受少數(shù)不匹配的基因，這可能會(huì)導(dǎo)致少數(shù)核苷酸不匹配的基因發(fā)生不期望的沉默。此外，siRNA的有義鏈也可能下調(diào)其他無(wú)關(guān)基因的表達(dá)。最后，未經(jīng)修飾的siRNA還可能會(huì)導(dǎo)致Toll樣受體3 (TLR3)的激活，并對(duì)血液和淋巴系統(tǒng)產(chǎn)生不利影響。這些發(fā)現(xiàn)引發(fā)了對(duì)siRNA安全性和成藥性的大量擔(dān)憂。

為了最大限度地提高治療效果、減少或避免siRNA的副作用，研究人員在調(diào)查各種化學(xué)修飾模式和開(kāi)發(fā)多種不同的給藥系統(tǒng)方面做了大量努力。一系列修飾模式對(duì)siRNA療法的活性、穩(wěn)定性、特異性和生物安全性的影響已在臨床前和臨床中接受評(píng)估?；谥|(zhì)、類脂材料(lipidoids)、聚合物、多肽、外泌體、無(wú)機(jī)納米顆粒等的遞送材料也已經(jīng)在被調(diào)查研究中。

6月19日，來(lái)自國(guó)家納米科學(xué)中心、廣西醫(yī)科大學(xué)以及北京理工大學(xué)的幾位研究者在Nature子刊Signal Transduction and Targeted Therapy 雜志上最新發(fā)表了一篇題為“Therapeutic siRNA: state ofthe art”的綜述，對(duì)siRNA的修飾和傳遞技術(shù)的詳細(xì)發(fā)展進(jìn)行了討論[3]。同時(shí)，這篇文章也提供了siRNA療法發(fā)展的一個(gè)歷史回顧。

以下參考文中圖表，摘編部分要點(diǎn)內(nèi)容：

如前文所述，在siRNA療法發(fā)展的早期階段，許多藥物的設(shè)計(jì)是基于完全未經(jīng)修飾或輕微修飾的siRNA，以到達(dá)適當(dāng)?shù)慕M織，然后沉默靶基因。這些分子能夠在體內(nèi)介導(dǎo)基因沉默，特別是在接受局部藥物治療的組織中，例如眼睛。然而，使用這些完全未經(jīng)修飾或輕微修飾的siRNA不僅可能療效有限，還會(huì)存在潛在的脫靶效應(yīng)。例如，Kleinman及其同事觀察到，被開(kāi)發(fā)用于治療年齡相關(guān)性黃斑變性的siRNA療法bevasiranib（靶向VEGFA）和AGN211745（靶向VEGFR1）觸發(fā)了TLR3及其適配器分子TRIF的顯著激活，誘導(dǎo)了白細(xì)胞介素-12和干擾素-γ的分泌。

化學(xué)修飾siRNAs，如以2′-O-methyl(2′-OMe)或2′-methoxyethyl (2′-MOE)基團(tuán)取代2′-OH的siRNA、以鎖核酸（locked nucleic acid, LNA）和非鎖核酸(unlocked nucleic acid，UNA)或乙二醇核酸(glycol nucleic acid，GNA) 取代某些核苷酸的siRNA，能夠有效地抑制免疫刺激性siRNA驅(qū)動(dòng)的先天免疫激活，提高活性和特異性，減少脫靶誘導(dǎo)的毒性（圖2）。

為了提高siRNA的效力和降低其潛在毒性，科學(xué)家們已經(jīng)開(kāi)發(fā)并測(cè)試了大量的化學(xué)修飾模式。根據(jù)在核苷酸中的修飾位點(diǎn)，用于siRNA的化學(xué)修飾和類似物的結(jié)構(gòu)可分為三大類：1）膦酸修飾；2）核糖修飾；3）堿基修飾，在圖2中分別用紅色、紫色和藍(lán)色表示。通常，這些修飾被同時(shí)引入siRNA中。例如，ONPATTRO?同時(shí)使用了2′-OMe和 2′-deoxy-2′-fluoro (2′-F)修飾；QPI-1007的反義鏈進(jìn)行了2 2′-OMe修飾，正義鏈中使用了一個(gè)“inverted deoxyabasic moiety”和一個(gè)L-DNA胞苷核苷酸進(jìn)行修飾；inclisiran (ALN-PCSsc)同時(shí)用phosphorothioate(PS)、2′-OMe、2′-F和2′-deoxy進(jìn)行了修飾（圖3）。

圖3 siRNA化學(xué)修飾的代表性設(shè)計(jì)，包括了ONPATTRO?、QPI-1007、GIVLAARI?和inclisiran的序列和修飾細(xì)節(jié)。(來(lái)源：Signal Transduction and Targeted Therapy )

系統(tǒng)給藥外源性siRNA需要繞過(guò)一系列障礙才能實(shí)現(xiàn)基因沉默，如核酸酶降解、短暫的循環(huán)、血液循環(huán)中的免疫識(shí)別、在目標(biāo)組織中的積累、有效的跨膜運(yùn)輸以及從內(nèi)體和溶酶體逃逸到細(xì)胞質(zhì)中。通過(guò)加入化學(xué)修飾，核酸酶降解和免疫識(shí)別方面的挑戰(zhàn)已經(jīng)得到了很好的解決，但一些其它障礙仍需克服。

在血液循環(huán)中，非特異性結(jié)合和腎小球?yàn)V過(guò)都會(huì)阻礙siRNA在目標(biāo)組織中的積累。負(fù)載siRNA的納米制劑的中性表面電荷有利于避免在循環(huán)中不利結(jié)合的發(fā)生。而配體- siRNA偶聯(lián)物能夠通過(guò)配體（如碳水化合物、肽、抗體、適配體、小分子等）與表面受體之間的特異性識(shí)別和相互作用將siRNA轉(zhuǎn)運(yùn)到所需的組織和細(xì)胞中。這種主動(dòng)靶向策略不僅可以減少siRNA在非預(yù)期組織中的積累，從而降低或避免不良副作用和毒性，還能夠在低劑量下實(shí)現(xiàn)有效的基因沉默。

siRNA長(zhǎng)約7-8 nm，直徑約2-3 nm。這種分子太大，不能穿過(guò)細(xì)胞膜，但又小到可以被腎小球自由清除。因此，一旦siRNAs離開(kāi)血液，它們就會(huì)在膀胱中積累，并在幾分鐘到半小時(shí)內(nèi)迅速?gòu)捏w內(nèi)排出，這就阻止了它們?cè)谀繕?biāo)組織或細(xì)胞中積累。將siRNA包封在囊泡中或?qū)⑵渑c特定配體偶聯(lián)，能夠有效避免腎臟的清除，更重要的是，可以將siRNA遞送到所需的組織或細(xì)胞。脂質(zhì)納米顆粒(LNPs)、dynamic polyconjugates (DPC?)和GalNAc–siRNA偶聯(lián)物都能有效地將siRNA遞送至肝細(xì)胞(圖4、圖5)

由于相對(duì)較高的分子量(~13-16 kD)和凈負(fù)電荷會(huì)阻止人工siRNA穿過(guò)細(xì)胞膜。因此，研究人員試圖確定是否有細(xì)胞可以在沒(méi)有載體的情況下內(nèi)化siRNA。研究得出的結(jié)論是：裸siRNA（naked siRNA）只能被少數(shù)細(xì)胞吸收，如視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGCs)和神經(jīng)元。此外，研究人員還致力于鑒定各種載體，以實(shí)現(xiàn)高效的跨膜傳遞。陽(yáng)離子細(xì)胞穿透肽(CPPs)成為了早期研究的首選。CPPs的尾部通常帶有富含精氨酸的序列，能夠通過(guò)胍鹽基團(tuán)與細(xì)胞表面的負(fù)磷酸鹽、硫酸鹽和羧酸鹽相互作用形成雙齒鍵。這種相互作用會(huì)導(dǎo)致膜孔形成，使得細(xì)胞吸收siRNA。實(shí)現(xiàn)跨膜運(yùn)輸?shù)牧硪粋€(gè)策略是，用帶正電荷的脂質(zhì)或聚合物中和siRNA的負(fù)電荷，使siRNA更容易結(jié)合到膜上，以及更容易通過(guò)吸附胞飲作用內(nèi)化。

最后一步，siRNAs必須有效地從內(nèi)體和溶酶體逃到細(xì)胞質(zhì)中。大多數(shù)非病毒類載體主要通過(guò)內(nèi)吞途徑進(jìn)入細(xì)胞，內(nèi)吞后的載體會(huì)與生物膜成分組裝成內(nèi)體，之后通過(guò)多種機(jī)制發(fā)展為溶酶體，而溶酶體中有大量的降解酶，會(huì)使其包含的基因藥物發(fā)生降解而失效，因此，一種有效的非病毒載體應(yīng)能夠促進(jìn)基因藥物快速?gòu)膬?nèi)體中逃離。許多遞送系統(tǒng)使用一個(gè)pH敏感單元來(lái)響應(yīng)內(nèi)體和溶酶體的pH變化，在那里它們將吸收H⁺，在表面呈現(xiàn)一個(gè)正電荷。然后，內(nèi)體或溶酶體的滲透壓會(huì)增加，導(dǎo)致Cl^-和H₂O在內(nèi)部流動(dòng)。最后，這些變化可能導(dǎo)致膜破裂、siRNA被釋放到細(xì)胞質(zhì)中。然而，內(nèi)體釋放的潛在機(jī)制仍有待進(jìn)一步闡明。因?yàn)橹挥?%-2%內(nèi)化的LNP-loaded siRNAs可被釋放到細(xì)胞質(zhì)中，而且這只發(fā)生在內(nèi)化后的有限時(shí)間內(nèi)。因此，進(jìn)一步理解siRNA的逃逸機(jī)制以及如何提高逃逸效率對(duì)siRNA藥物的開(kāi)發(fā)具有重要意義。最近有研究報(bào)道了新型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜修飾的hybrid nanoplexes (EhCv/siRNA NPs)。與未修飾的nanoplexes相比，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜修飾的hybrid nanoplexes在體內(nèi)和體外都顯示出更高的RNAi活性。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的功能蛋白在siRNA的胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮了重要作用，可幫助siRNA通過(guò)內(nèi)體-高爾基- ER途徑（而不是內(nèi)體-溶酶體途徑）到達(dá)細(xì)胞質(zhì)，從而避免了siRNA的溶酶體降解。此外，電穿孔可使siRNA能夠直接穿過(guò)細(xì)胞膜，這也是規(guī)避內(nèi)體逃逸問(wèn)題的有效途徑。

如前文所述，到目前為止，有兩種RNAi療法——ONPATTRO?和GIVLAARI?——已獲批上市。另有兩種siRNA——lumasiran(ALN-GO1)和inclisiran已向FDA提交新藥申請(qǐng)(NDA)。7個(gè)siRNAs正在進(jìn)行III期臨床研究，更多的候選siRNAs仍處于早期開(kāi)發(fā)階段。下表總結(jié)了部分RNAi療法的臨床和臨床前活性。

表1 部分RNAi療法的臨床和臨床前活性

（點(diǎn)擊查看大圖）

如圖6所示，按目標(biāo)組織來(lái)看，肝、腫瘤、皮膚、血液、眼、腎等組織均有靶向它們的siRNA和miRNA正處于臨床開(kāi)發(fā)階段。其中，靶向肝臟的項(xiàng)目最為豐富，其次是腫瘤、皮膚。

由于siRNA作用機(jī)制的獨(dú)特性，這類分子能夠用來(lái)靶向幾乎所有疾病相關(guān)的興趣基因。siRNA療法的研發(fā)時(shí)間也比小分子、單克隆抗體和蛋白質(zhì)短得多。隨著用于罕見(jiàn)疾病治療的ONPATTRO?和GIVLAARI?成功商業(yè)化，siRNA療法很快將在治療常見(jiàn)疾病(如血脂異常)方面取得另一個(gè)里程碑，因?yàn)閕nclisiran的幾項(xiàng)III期臨床研究均顯示出了優(yōu)秀的數(shù)據(jù)。

得益于對(duì)修飾模式和遞送系統(tǒng)的長(zhǎng)期探索，siRNA療法的有效劑量已經(jīng)從數(shù)毫克（milligrams）降低到了10^?3毫克，半衰期已經(jīng)從分鐘級(jí)（minutes）延長(zhǎng)到了數(shù)月。攜帶復(fù)雜化學(xué)修飾的GalNAc–siRNA偶聯(lián)物使siRNA療法每季度一次或一年兩次皮下給藥成為了可能，這是醫(yī)藥史上從未實(shí)現(xiàn)的偉大成就。

在開(kāi)發(fā)了用于siRNA肝臟遞送的GalNAc–siRNA偶聯(lián)物后，科學(xué)家們也在致力于開(kāi)發(fā)肝外遞送平臺(tái)。目前，在向腎、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和眼部靶向遞送siRNA方面已經(jīng)取得了一些重要進(jìn)展。該綜述的作者們認(rèn)為，不斷升級(jí)的siRNA技術(shù)必將改變我們未來(lái)的生活。

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