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親和素是一種糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD，每個(gè)分子由4個(gè)亞基組成，可以和4個(gè)生物素分子親密結(jié)合。 熒光素(FITC)標(biāo)記親和素(FITC-Avidin)操作步驟： （一）獲得目的基因 1、通過PCR方法：以含目的基因的克隆質(zhì)粒為模板，按基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物（在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點(diǎn)），PCR循環(huán)獲得所需基因片段。 2、通過RT-PCR方法：用TRIzol法從細(xì)胞或組織中提取總RNA，以mRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA第一鏈，以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR循環(huán)獲得產(chǎn)物。 （二）構(gòu)建重組表達(dá)載體 1、熒光素(FITC)標(biāo)記親和素(FITC-Avidin)載體酶切：將表達(dá)質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶（同引物的酶切位點(diǎn)）進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物行瓊脂糖電泳后，用膠回收Kit或凍融法回收載體大片段。 2、PCR產(chǎn)物雙酶切后回收，在T4DNA連接酶作用下連接入載體。 （三） 獲得含重組表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)菌種 1、 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，根據(jù)重組載體的標(biāo)志（抗Amp或藍(lán)白斑）作篩選，挑取單斑，堿裂解法小量抽提質(zhì)粒，雙酶切初步鑒定。 2、 測(cè)序驗(yàn)證目的基因的插入方向及閱讀框架均正確,進(jìn)入下步操作。否則應(yīng)篩選更多克隆，重復(fù)亞克隆或亞克隆至不同酶切位點(diǎn)。 3、 以此重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌的感受態(tài)細(xì)胞。 （四）誘導(dǎo)表達(dá) 1、 熒光素(FITC)標(biāo)記親和素(FITC-Avidin)挑取含重組質(zhì)粒的菌體單斑至2ml LB（含Amp50μg/ml）中37℃過夜培養(yǎng)。 2、 按1∶50比例稀釋過夜菌，一般將1ml菌加入到含50mlLB培養(yǎng)基的300ml 培養(yǎng)瓶中, 37℃震蕩培養(yǎng)至OD600≌0.4-1.0（*0.6，大約需3hr）。 3、 取部分液體作為未誘導(dǎo)的對(duì)照組,余下的加入IPTG誘導(dǎo)劑至終濃度0.4mM 作為實(shí)驗(yàn)組,兩組繼續(xù)37℃震蕩培養(yǎng)3hr。 4、 分別取菌體1ml, 離心12000g×30s收獲沉淀，用100μl 1%SDS重懸，混 勻,70℃10min。 5、離心12000g×1min，取上清作為樣品,可做SDS-PAGE等分析。 Avidin-FITC 熒光素修飾標(biāo)記親和素詳情介紹： 中文名稱：異硫氰酸熒光素標(biāo)記親和素 英文名稱：Avidin-FITC 外觀：液體 規(guī)格：ml 純度：≥95% 激發(fā)波長(zhǎng)/ 發(fā)射波：490nm/520nm 儲(chǔ)存條件：-20℃ 保存時(shí)間：1 year 應(yīng)用范圍：熒光激活細(xì)胞分選；組織化學(xué)染色 Avidin-TRITC 四甲基異硫氰酸羅丹明標(biāo)記親和素 中文名稱：四甲基異硫氰酸羅丹明標(biāo)記親和素 英文名稱：Avidin-TRITC
外觀：液體 規(guī)格：ml 純度：≥95% 儲(chǔ)存條件：-20℃ 保存時(shí)間：1 year 應(yīng)用范圍：熒光激活細(xì)胞分選；組織化學(xué)染色 用途：僅供科研用 產(chǎn)地：西安 四甲基異硫氰酸羅丹明(TRITC)：能與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)結(jié)合，比FITC穩(wěn)定性好，在生理?xiàng)l件下對(duì)pH值變化不敏感，熒光強(qiáng)度受自發(fā)熒光干擾小。 Avidin-CY3 Avidin-CY5 Avidin (without modification) Avidin-Sepharose Avidin-FITC Avidin-TRITC Concanavalin A-CY5 Concanavalin A-CY3 Concanavalin A-CY7 Concanavalin A-Biotin Concanavalin A-SH Concanavalin A-TRITC Concanavalin A-Sepharose 以上資料來自小編西安瑞禧生物（YQ2020.11） |
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