基于高通量技術(shù)的微生物組研究實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

——微生物組研究，從方案設(shè)計(jì)到寫(xiě)作套路(二)

作者：王曉雯 凌波微課

版本1.0.2，更新日期：2020年9月22日

好文章離不開(kāi)好設(shè)計(jì)

研究第一步就是要結(jié)合自己的研究目的和經(jīng)費(fèi)情況，選擇適合的技術(shù)（可以參照上一節(jié)——基于高通量測(cè)序的微生物組研究技術(shù)簡(jiǎn)介，選擇合適的技術(shù)類(lèi)型），當(dāng)然這與整個(gè)研究思路也是密切相關(guān)的。當(dāng)確定了研究目的和想要說(shuō)明的問(wèn)題，下一步就是要考慮的，就是要捋清我們的研究思路，設(shè)計(jì)一個(gè)全面豐富的微生物組學(xué)研究方案了。

在近些年的微生物組學(xué)研究中，除了基于高通量測(cè)序的多組學(xué)研究，培養(yǎng)組學(xué)和生態(tài)表型研究也得到越來(lái)越多研究者的關(guān)注1。

但無(wú)論是哪種研究方向和何種研究策略，微生物組研究關(guān)注的核心，依舊主要集中在兩個(gè)大方向-微生物組的群落結(jié)構(gòu)和功能特征（包括下游驗(yàn)證 ）。

怎樣才能讓我們的研究更加豐滿，獲得更高水平的研究成果，進(jìn)而發(fā)表更高質(zhì)量的科研文章呢？就要整合我們的研究思路和合適的技術(shù)了。

完善的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

火爆的微生物組，目前常見(jiàn)的研究多為多組學(xué)研究設(shè)計(jì)——整合不同層次的研究技術(shù)和手段，從微生物的構(gòu)成、個(gè)體、基因、功能和分子機(jī)制，全面闡述一個(gè)微生物組的全貌，這樣的設(shè)計(jì)大多有“套路”可循（如下）。

微生物組學(xué)領(lǐng)域的研究，在醫(yī)學(xué)方向和環(huán)境方向分別有各自的特點(diǎn)。今天在這里就跟大家通過(guò)一些案例，來(lái)分別聊聊，在這兩個(gè)常見(jiàn)的研究方向中，關(guān)于微生物組研究的那些或經(jīng)典的、或獨(dú)出心裁的方案設(shè)計(jì)！

環(huán)境類(lèi)研究中常見(jiàn)的設(shè)計(jì)類(lèi)型

例1: “低配”技術(shù)照樣做出好文章

雖然高通量的技術(shù)專(zhuān)家，一般很樂(lè)于為研究者提供多組學(xué)關(guān)聯(lián)的技術(shù)方案——既是研究的熱門(mén)方向，又是發(fā)高分文章的好選擇——但實(shí)際上，高通量技術(shù)選擇“低配”版并不等同于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和文章水平的“低配版”。

2020年發(fā)表于Science of the Total Environment(IF=5.589)的水生植物Vallisneria natans

對(duì)水深響應(yīng)的研究就是一個(gè)經(jīng)典代表2。

研究設(shè)計(jì)很簡(jiǎn)單也十分套路(下圖)：在反應(yīng)器中模擬不同水位深度進(jìn)行植物的栽培，研究這些植物對(duì)培養(yǎng)水深的相應(yīng)情況，針對(duì)微生物組的研究選擇了最簡(jiǎn)單的16S rRNA基因測(cè)序。

這篇文章可以說(shuō)是簡(jiǎn)單技術(shù)應(yīng)用的經(jīng)典?？梢钥闯龇纸M設(shè)計(jì)上是很中規(guī)中矩的，但是研究者絲毫沒(méi)有放松對(duì)細(xì)節(jié)的要求——除了基礎(chǔ)培養(yǎng)介質(zhì)的安排,以及模擬湖底的黑暗環(huán)境外,在相關(guān)水質(zhì)理化性質(zhì)檢測(cè)及植株的生理特征數(shù)據(jù)采集上也是頗下了一番功夫的。此外,研究還結(jié)合了掃描電鏡的形態(tài)學(xué)觀察和總有機(jī)碳的檢測(cè)來(lái)說(shuō)明微生物的附著（下圖2）和有機(jī)碳的積累。

圖注：掃描電鏡顯示不同水深度下植物表面生物膜的微生物附著情況2。

結(jié)合掃描電鏡的微生物附著觀察，利用擴(kuò)增子測(cè)序手段檢測(cè)不同微生物類(lèi)群的分布——沒(méi)有特別絢麗的作圖，僅通過(guò)簡(jiǎn)單的柱狀圖和物種分布heatmap，直觀展示出植株對(duì)不同培養(yǎng)水深的微生物群落分布響應(yīng)情況。

圖注：基于擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)，不同水深培養(yǎng)條件下植株表面生物膜的微生物群落構(gòu)成柱狀圖2。

在擴(kuò)增子研究已經(jīng)開(kāi)展的如火如荼的大環(huán)境下，這篇文章依舊可以從詳盡的環(huán)境理化因子的采集和整理分析入手，通過(guò)深入淺出的討論，僅利用的高通量測(cè)序的擴(kuò)增子技術(shù)就發(fā)表了影響因子達(dá)5分以上的文章，其明朗干脆的設(shè)計(jì)取樣，完備的信息采集和邏輯清晰的討論論述無(wú)疑起到了至關(guān)重要的作用。

例2:單一技術(shù)+多種分析（分箱+耐藥基因分析）

這一篇文章是研究城市污水排放與抗生素抗性基因擴(kuò)散的宏基因組研究，于2019年發(fā)表于Microbiome上3。研究重點(diǎn)關(guān)注城市生活于環(huán)境的相互作用，利用沿海城市污水和海灘取樣，開(kāi)展宏基因組測(cè)序，但沒(méi)有局限于隨機(jī)宏基因組的標(biāo)準(zhǔn)分析流程，研究把關(guān)注點(diǎn)轉(zhuǎn)向了單菌基因組組裝及抗生素抗性挖掘的方向。

主要實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和分組設(shè)計(jì)如下：

研究實(shí)驗(yàn)方法：隨機(jī)宏基因組測(cè)序

研究分析方法：常規(guī)宏基因組分析+宏基因組分箱(binning)組裝+ 宏基因組耐藥基因(ARGs)注釋

這篇研究的亮點(diǎn)在于通過(guò)多種分析方法，深入比對(duì)了兩種樣本的群落結(jié)構(gòu)共性與特性特征，深度挖掘其中抗生素抗性基因的分布，深究城市污水及海灘樣本中抗性基因的種類(lèi)及豐度差異。

分析的多樣化一樣可以實(shí)現(xiàn)類(lèi)似“多組學(xué)”研究的功能，此外，各種高大上的科研作圖也是文章的亮點(diǎn)所在（瞅下邊兒），而在微生物的宏基因組研究中，這些絢麗的作圖都可以通過(guò)數(shù)據(jù)手段實(shí)現(xiàn)。如果研究的經(jīng)費(fèi)有限，設(shè)計(jì)也比較簡(jiǎn)單，那么這篇文章帶給我們的啟示是：不妨在多種數(shù)據(jù)分析和作圖上多下功夫呦~

例3:經(jīng)典的微生物多組學(xué)研究（擴(kuò)增子+宏基因組+宏轉(zhuǎn)錄組+宏蛋白組）

說(shuō)到多組學(xué)分析，土壤科學(xué)中必會(huì)提及的一篇宏組學(xué)研究當(dāng)推2015年Nature發(fā)表的不同類(lèi)型土壤微生物組研究4。通過(guò)對(duì)三種不同類(lèi)型土壤的多組學(xué)研究（擴(kuò)增子、宏基因組、宏轉(zhuǎn)錄組和宏蛋白組），展示三種土壤類(lèi)型的物種及功能多樣性分布。研究設(shè)計(jì)可謂是多組學(xué)研究的經(jīng)典：

（備注： MG-宏基因組； MT-宏轉(zhuǎn)錄組；MP-宏蛋白組）

研究結(jié)果中更具有突破性的是——不僅僅展示不同類(lèi)型樣地的結(jié)果差異，還將不同技術(shù)手段獲得的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了多樣化的比較和展示：

此外，研究中還引入的三元相圖，維恩圖等可視化方案，針對(duì)不同的土壤類(lèi)型樣本中存在的特色微生物類(lèi)群進(jìn)行研究，深度挖掘了土壤類(lèi)型中的特征性微生物物種及功能，這也是目前的多組學(xué)研究中常見(jiàn)的比較方法——直觀展現(xiàn)差異，挖掘差異來(lái)源，說(shuō)明研究結(jié)果，得出最終結(jié)論。

例4: 從群體回歸單菌的研究（分箱）

除多組學(xué)技術(shù)之外，由于培養(yǎng)組的興起，越來(lái)越多的學(xué)者將研究的目光，聚焦在利用宏基因技術(shù)，獲得單菌基因組組裝結(jié)果的研究上。這里就包括基于純算法組裝的宏基因組分析算法和基于三維基因組技術(shù)的HiC-Meta技術(shù)。

2018年，Nature報(bào)道了利用宏基因組分箱技術(shù)開(kāi)展的土壤細(xì)菌研究5，深度挖掘了新的土壤微生物類(lèi)群及功能，結(jié)合宏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，報(bào)道了多元化的土壤次生代謝產(chǎn)物合成基因。

這篇文章主要偏微生物的功能研究，功能方面又是通過(guò)分箱組裝，重點(diǎn)針對(duì)一些優(yōu)勢(shì)菌深入調(diào)研功能：研究獲得了376株近乎完整的土壤微生物基因組序列，鑒定并發(fā)現(xiàn)了千余種生物合成基因簇及抗生素合成基因。通過(guò)DNA和RNA兩個(gè)水平層面研究，深入討論了土壤微生物組中的次生代謝產(chǎn)物合成潛力及功能。

分箱算法針對(duì)環(huán)境樣本中的單菌基因組提供了較為低成本的研究路徑，但針對(duì)環(huán)境中微生物之間的項(xiàng)目作用，研究環(huán)境微生物的質(zhì)粒信息，抗生素抗性基因攜帶等，采用HiC-Meta技術(shù)則更勝一籌——HiC-Meta（又名ProxiMeta）方法除了可以獲得更精確的單菌組裝結(jié)果，更能將質(zhì)粒與宿主基因組關(guān)聯(lián)，監(jiān)測(cè)抗性基因的水平轉(zhuǎn)移，噬菌體侵染細(xì)菌等過(guò)程。在研究環(huán)境微生物的生態(tài)功能上具有重要意義。在2019年ISME發(fā)表的廢水研究中6，研究者設(shè)計(jì)了兩組研究：一組為污水樣本，另一組在污水中定量加入含有特定質(zhì)粒的大腸桿菌。利用HiC-Meta技術(shù)，開(kāi)展了樣本中優(yōu)勢(shì)微生物基因組的組裝，并深入單菌水平，研究了污染水體中抗性基因的擴(kuò)散情況及ARGs富集的菌體類(lèi)型。一方面，研究利用加入的“內(nèi)參”大腸桿菌評(píng)估了單菌組裝的準(zhǔn)確性（完整度>97%），并驗(yàn)證了這個(gè)方法可以將特定質(zhì)粒與“內(nèi)參”菌的關(guān)聯(lián)：

既然在“內(nèi)參”菌體中可以實(shí)現(xiàn)宿主與質(zhì)粒、噬菌體與宿主菌的關(guān)聯(lián)，那么這項(xiàng)技術(shù)自然可以用于“非分離培養(yǎng)”前提下宿主與ARGs的關(guān)聯(lián)（如下圖 示污水組的關(guān)聯(lián)研究結(jié)果6）：

例6: 從群體研究實(shí)現(xiàn)單菌的培養(yǎng)組學(xué)和單菌研究（擴(kuò)增子測(cè)序+宏基因組binning組裝+單菌分離培養(yǎng)+單菌功能研究）

從群體，回歸單菌，無(wú)疑是完成了微生物組研究中培養(yǎng)組關(guān)注的重要內(nèi)容——在自然狀態(tài)下保存微生物個(gè)體的本真，全面了解微生物的功能特征和營(yíng)養(yǎng)方式，對(duì)下游的培養(yǎng)組（微生物分離培養(yǎng)）具有現(xiàn)實(shí)指導(dǎo)意義。此外，無(wú)論是基于Binning還是HiC-Meta獲得單菌基因組的信息，都可以利用注釋獲得的單菌的抗性及代謝特征等轉(zhuǎn)向指導(dǎo)單菌的分離培養(yǎng)，在下游研究中，就可以將分離的單菌用于基因組研究，諸如研究微生物的個(gè)性化功能、系統(tǒng)進(jìn)化，比較基因組研究闡述不同菌株的基因組結(jié)構(gòu)及功能差異等。

2018年，有學(xué)者利用宏基因組測(cè)序及分箱組裝，探索富集培養(yǎng)中某優(yōu)勢(shì)菌的特殊生長(zhǎng)傾向，并利用這種傾向，額外分理出Pimelobacter sp. LG209，結(jié)合菌株的分離培養(yǎng)，進(jìn)一步通過(guò)功能培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)揭示了Arthrobacter sp. D2和Pimelobacter sp. LG209在有氧降解磺胺嘧啶過(guò)程中的合作關(guān)系7（doi:10.1021/acs.est.7b05913, IF=6.198）。

圖注：D2菌株單獨(dú)培養(yǎng)和D2與LG209共培養(yǎng)對(duì)磺胺嘧啶（SDZ）降解和礦化的作用7。

動(dòng)物和醫(yī)學(xué)臨床研究的設(shè)計(jì)思路：

類(lèi)似的思考路線，醫(yī)學(xué)微生物組研究也是循著從群落結(jié)構(gòu)研究到分子功能及機(jī)制研究，再貫穿下游組學(xué)和其他技術(shù)手段驗(yàn)證的思路來(lái)開(kāi)展的。

套路可以閃光輝，跳出套路之外，更能發(fā)揮出組學(xué)研究的萬(wàn)丈光芒~ 今天，就跟大家分享一些醫(yī)學(xué)微生物組研究中，那些看似不經(jīng)意卻驚艷的研究設(shè)計(jì)。

例1：閃亮的“套路”

一個(gè)16 rDNA測(cè)序，能發(fā)多高水平的文章呢？ 還只有12對(duì)健康人與病人樣本？

一篇針對(duì)肝硬化研究的項(xiàng)目告訴你，《AP&T》（IF=7.2）也可以！

2018年，《AP&T》發(fā)表的一篇丙肝藥物對(duì)肝硬化患者腸道微生態(tài)的影響研究就“出套路而不俗”的脫穎而出8。研究只有三個(gè)分組：正常對(duì)照組、DAA治療前HCV病患組和DAA治療后HCV病患組。

就這樣簡(jiǎn)約的分組，病患只有12例病人樣本，16s rDNA測(cè)序。是如何做到這樣的水平呢？

簡(jiǎn)約一定不簡(jiǎn)單！雖只有12個(gè)病患，但這些患者是從187例病人中通過(guò)了治療追蹤和層層篩選最終獲得的“經(jīng)典樣本“，僅生理指標(biāo)的測(cè)評(píng)，文中就給出了滿滿一頁(yè)的列表……可謂煞費(fèi)苦心。 研究雖然只是簡(jiǎn)單的套路和16S測(cè)序，也依舊走心的開(kāi)展了不同組之間差異微生物類(lèi)群的分析，并結(jié)合功能注釋進(jìn)行了微生物與功能的關(guān)聯(lián)。

好科研貴在“走心”，簡(jiǎn)約卻并不簡(jiǎn)單。這樣的”套路“，真的可以學(xué)起來(lái)呦~

例2：“土豪”無(wú)分組研究

相信會(huì)有一部分研究者有這樣的困擾——大背景研究。想去了解一些特定人群的腸道菌群特征，并沒(méi)有所謂的實(shí)驗(yàn)組與處理組的分別。如此能寫(xiě)出生動(dòng)的故事來(lái)么？

Of course Yes??！不但能，這種大規(guī)模作業(yè)的形式，還可能發(fā)個(gè)CNS系列呢！

《Science》此前就發(fā)過(guò)多篇類(lèi)似研究，比如荷蘭人群的腸道微生態(tài)構(gòu)成和多樣性標(biāo)記研究9。

1179個(gè)荷蘭人，共收集了1135份樣本數(shù)據(jù)，開(kāi)展16S和宏基因組測(cè)序。相關(guān)體質(zhì)、疾病、用藥、生活習(xí)慣及飲食特征數(shù)據(jù)也被做了詳實(shí)的記錄。如此一來(lái)，一方面獲得了荷蘭人群的腸道群落結(jié)構(gòu)和功能特征的信息（下圖9）：

另一方面，也挖掘出與人的體質(zhì)特征等指標(biāo)相關(guān)的一些微生物功能特質(zhì)（下圖），為我們更好的了解人群特征體提供了更深入的視角。

例3：1+1 > 2

   人體微生物組研究無(wú)數(shù)次在強(qiáng)調(diào)——微生物組就是人體的第二基因組。

   如此一來(lái)，研究人就不能只單純的研究人，還要研究我們的那個(gè)“它”?；蚪M亦然?！?/span>mBio》一篇肥胖癥患兒的膳食調(diào)節(jié)菌群研究就是如此10：

一名肥胖癥患兒，進(jìn)行為期105天的膳食調(diào)節(jié)干預(yù)，根據(jù)配餐劃分為三個(gè)干預(yù)階段，分不同時(shí)間點(diǎn)取樣，研究患兒的腸道菌群宏基因組變化10（下圖）。

在宏基因組研究中，發(fā)現(xiàn)B. pseudocatenulatum的五個(gè)株系在膳食調(diào)整過(guò)程中產(chǎn)生了響應(yīng)10（下圖）。

如此，研究者對(duì)著五個(gè)菌株的基因組展開(kāi)了研究，深入討論了不同株系的不同響應(yīng)策略及對(duì)人體健康的影響。

人體腸道微生物組測(cè)序交叉整合單菌的分離培養(yǎng)和基因組研究，也是醫(yī)學(xué)微生物研究中越來(lái)越受關(guān)注的一種研究思路呢！伴隨而來(lái)的培養(yǎng)組研究和微生物制劑開(kāi)發(fā)研究也愈加轟轟烈烈了~

例4：玩兒轉(zhuǎn)多組學(xué)（分箱+多組學(xué)關(guān)聯(lián)）

多組學(xué)關(guān)聯(lián)分析，顧名思義，將多種組學(xué)技術(shù)整合，深度解析微生物組從群落結(jié)構(gòu)到功能潛力再到功能發(fā)揮的全貌。伴隨著宏組學(xué)技術(shù)發(fā)展，多組學(xué)關(guān)聯(lián)分析的思路也越來(lái)越廣。 2018年，一篇糖尿病人腸道菌群研究，循著多組學(xué)技術(shù)的思路，將糖尿病的膳食干預(yù)研究推上了《Science》熱門(mén)11，更成為那個(gè)春天的刷屏熱帖。

一起來(lái)看看這篇文章的幾個(gè)亮點(diǎn)：

1. 利用宏組學(xué)測(cè)序手段，深度挖掘了不同處理的病人腸道菌群的結(jié)構(gòu)變化；

2. 引入代謝組研究，重點(diǎn)觀測(cè)短鏈脂肪酸水平在膳食干預(yù)過(guò)程中的變化，深度挖掘微生物組中產(chǎn)生短鏈脂肪酸的基因構(gòu)成變化；

3. 更通過(guò)宏基因組組裝，獲得了樣本中一些關(guān)鍵細(xì)菌的基因組信息，識(shí)別了在膳食干預(yù)過(guò)程中有正向和負(fù)向作用的細(xì)菌類(lèi)群（不基于分離培養(yǎng)，Binning組裝）；

4. 整合關(guān)聯(lián)，將短鏈脂肪酸產(chǎn)生菌與膳食干預(yù)的代謝變化相關(guān)聯(lián)，深度解析膳食干預(yù)的微生物組學(xué)機(jī)制。

這篇研究中，除了多組學(xué)整合，非培養(yǎng)方法獲得復(fù)雜微生物組樣本中單菌基因組信息亦是很多研究者關(guān)注的熱點(diǎn)。除了使用的binning算法外，Hi-C等基因組技術(shù)的應(yīng)用也能更好的實(shí)現(xiàn)組裝，并進(jìn)一步拓展和深化宏組學(xué)研究。

例5：動(dòng)物模型造起來(lái)

動(dòng)物模型在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床科研中可謂意義重大——一方面，復(fù)雜的人體研究可能存在很多不可控的潛在變量（遺傳因素，生活習(xí)慣等），通過(guò)動(dòng)物模型可實(shí)現(xiàn)整齊劃一的處理；另一方面，有一些臨床樣本非常難得，在這種情況下動(dòng)物模型可幫助我們更好實(shí)現(xiàn)研究取樣。

將人體研究與動(dòng)物模型結(jié)合在一起，是進(jìn)行醫(yī)學(xué)臨床科研的絕好思路。

2017年Science報(bào)道了口腔細(xì)菌在腸道中的異位定殖12，就是循著這樣的思路——看一下這篇文章的研究思路和采用的技術(shù)手段：

研究剖析了不同患病群體病患腸道中口腔耐氧菌群的分布（下圖），并將病人的口腔樣本應(yīng)用于小鼠建模，研究相關(guān)促炎因子的變化：

在動(dòng)物模型研究中，利用組學(xué)技術(shù)獲得腸道內(nèi)異位定殖的口腔細(xì)菌類(lèi)群（下圖左），并開(kāi)展了單菌基因組測(cè)序，深度挖掘相應(yīng)菌株在免疫過(guò)程中發(fā)揮的作用（下圖右）。

此外結(jié)合轉(zhuǎn)錄組研究等技術(shù)手段，明確目標(biāo)菌株異位定殖引發(fā)炎癥反應(yīng)的誘導(dǎo)機(jī)制。

番外：醉翁之意不在“菌”

在一些研究設(shè)計(jì)中，微生物組研究及技術(shù)就并非關(guān)注的核心和技術(shù)支撐了~

某些研究中，會(huì)將微生物組的相關(guān)結(jié)果可作為表型數(shù)據(jù)。諸如應(yīng)用于遺傳圖譜研究, 來(lái)說(shuō)明遺傳背景與微生物群落結(jié)構(gòu)之間的相關(guān)性——如下面的兩篇關(guān)于皮膚微生物組的遺傳易感性研究13,14——研究者利用皮膚微生物構(gòu)成信息作為遺傳圖譜研究中的表型信息，對(duì)構(gòu)建的家系群體的小鼠進(jìn)行基因組關(guān)聯(lián)，以探索小鼠基因組信息中有哪些基因可能控制小鼠的皮膚表面微生物構(gòu)成，并進(jìn)一步繪制了遺傳圖譜——嚴(yán)格的講，這個(gè)研究已經(jīng)“跳出微生物組研究思路，不在此‘套路’，而在彼‘套路’之中了”，也成就了別樣的研究“經(jīng)典”。

從這幾個(gè)炫酷的設(shè)計(jì)不難看出，微生物組有很多的花式玩兒法，可化繁為簡(jiǎn)，可優(yōu)勢(shì)整合，亦可出奇制勝~

很多研究者會(huì)覺(jué)得，微生物組學(xué)的技術(shù)應(yīng)用，是廣泛的，甚至?xí)_(kāi)玩笑說(shuō)是“萬(wàn)金油”的。筆者作為一枚技術(shù)，接觸過(guò)的微生物組研究項(xiàng)目類(lèi)型真可謂“五花八門(mén)”——從熱門(mén)的“人體第二基因組”到火爆的“植物微生態(tài)”研究，從廣泛的生物學(xué)相關(guān)研究應(yīng)用，拓展到食品工業(yè)、藥物研究、化妝品領(lǐng)域、境保護(hù)檢測(cè)、建筑工程質(zhì)量監(jiān)督……微生物組學(xué)的研究應(yīng)用真的可謂是“跨界網(wǎng)紅”，火遍科研圈。

無(wú)論怎樣的研究，微生物研究的核心內(nèi)容都是有章可循的，但想要玩兒出花式亮眼的結(jié)果，更需要各界關(guān)注微生物組學(xué)的研究者們結(jié)合各自的領(lǐng)域?qū)ｉL(zhǎng)，“腦洞大開(kāi)”的研究設(shè)計(jì)，讓微生物組學(xué)研究在各個(gè)領(lǐng)域中綻放更多美麗的花朵。

責(zé)編：劉永鑫 中科院遺傳發(fā)育所

版本更新歷史

1.0.0，2020/9/3，王曉雯，初稿

1.0.1，2020/9/8，劉永鑫，大修

1.0.2，2020/9/22，劉永鑫，小修

1    Cristina Vilanova & Manuel Porcar. (2016). Are multi-omics enough? Nature Microbiology 1, 16101, doi: https:///10.1038/nmicrobiol.2016.101

2    Huimin Li, Qi Li, Xin Luo, Jie Fu & Jibiao Zhang. (2020). Responses of the submerged macrophyte Vallisneria natans to a water depth gradient. Science of the Total Environment 701, 134944, doi: https:///https:///10.1016/j.scitotenv.2019.134944

3    Pablo Fresia, Verónica Antelo, Cecilia Salazar, Matías Giménez, Bruno D’Alessandro, Ebrahim Afshinnekoo, Christopher Mason, Gastón H. Gonnet & Gregorio Iraola. (2019). Urban metagenomics uncover antibiotic resistance reservoirs in coastal beach and sewage waters. Microbiome 7, 35, doi: https:///10.1186/s40168-019-0648-z

4    Jenni Hultman, Mark P. Waldrop, Rachel Mackelprang, Maude M. David, Jack McFarland, Steven J. Blazewicz, Jennifer Harden, Merritt R. Turetsky, A. David McGuire, Manesh B. Shah, Nathan C. VerBerkmoes, Lang Ho Lee, Kostas Mavrommatis & Janet K. Jansson. (2015). Multi-omics of permafrost, active layer and thermokarst bog soil microbiomes. Nature 521, 208-212, doi: https:///10.1038/nature14238

5    Alexander Crits-Christoph, Spencer Diamond, Cristina N. Butterfield, Brian C. Thomas & Jillian F. Banfield. (2018). Novel soil bacteria possess diverse genes for secondary metabolite biosynthesis. Nature 558, 440-444, doi: https:///10.1038/s41586-018-0207-y

6    Thibault Stalder, Maximilian O. Press, Shawn Sullivan, Ivan Liachko & Eva M. Top. (2019). Linking the resistome and plasmidome to the microbiome. The ISME Journal 13, 2437-2446, doi: https:///10.1038/s41396-019-0446-4

7    Yu Deng, Yulin Wang, Yanping Mao & Tong Zhang. (2018). Partnership of Arthrobacter and Pimelobacter in Aerobic Degradation of Sulfadiazine Revealed by Metagenomics Analysis and Isolation. Environmental Science & Technology 52, 2963-2972, doi: https:///10.1021/acs.est.7b05913

8    Francesca Romana Ponziani, Lorenza Putignani, Francesco Paroni Sterbini, Valentina Petito, Anna Picca, Federica Del Chierico, Sofia Reddel, Riccardo Calvani, Emanuele Marzetti, Maurizio Sanguinetti, Antonio Gasbarrini & Maurizio Pompili. (2018). Influence of hepatitis C virus eradication with direct-acting antivirals on the gut microbiota in patients with cirrhosis. Alimentary Pharmacology and Therapeutics 48, 1301-1311, doi: https:///10.1111/apt.15004

9    Alexandra Zhernakova, Alexander Kurilshikov, Marc Jan Bonder, Ettje F. Tigchelaar, Melanie Schirmer, Tommi Vatanen, Zlatan Mujagic, Arnau Vich Vila, Gwen Falony, Sara Vieira-Silva, Jun Wang, Floris Imhann, Eelke Brandsma, Soesma A. Jankipersadsing, Marie Joossens, Maria Carmen Cenit, Patrick Deelen, Morris A. Swertz, Rinse K. Weersma, Edith J. M. Feskens, Mihai G. Netea, Dirk Gevers, Daisy Jonkers, Lude Franke, Yurii S. Aulchenko, Curtis Huttenhower, Jeroen Raes, Marten H. Hofker, Ramnik J. Xavier, Cisca Wijmenga & Jingyuan Fu. (2016). Population-based metagenomics analysis reveals markers for gut microbiome composition and diversity. Science 352, 565-569, doi: https:///10.1126/science.aad3369

10    Guojun Wu, Chenhong Zhang, Huan Wu, Ruirui Wang, Jian Shen, Linghua Wang, Yufeng Zhao, Xiaoyan Pang, Xiaojun Zhang, Liping Zhao & Menghui Zhang. (2017). Genomic Microdiversity of <em>Bifidobacterium pseudocatenulatum</em> Underlying Differential Strain-Level Responses to Dietary Carbohydrate Intervention. mBio 8, e02348-02316, doi: https:///10.1128/mBio.02348-16

11    Liping Zhao, Feng Zhang, Xiaoying Ding, Guojun Wu, Yan Y. Lam, Xuejiao Wang, Huaqing Fu, Xinhe Xue, Chunhua Lu, Jilin Ma, Lihua Yu, Chengmei Xu, Zhongying Ren, Ying Xu, Songmei Xu, Hongli Shen, Xiuli Zhu, Yu Shi, Qingyun Shen, Weiping Dong, Rui Liu, Yunxia Ling, Yue Zeng, Xingpeng Wang, Qianpeng Zhang, Jing Wang, Linghua Wang, Yanqiu Wu, Benhua Zeng, Hong Wei, Menghui Zhang, Yongde Peng & Chenhong Zhang. (2018). Gut bacteria selectively promoted by dietary fibers alleviate type 2 diabetes. Science 359, 1151-1156, doi: https:///10.1126/science.aao5774

12    Koji Atarashi, Wataru Suda, Chengwei Luo, Takaaki Kawaguchi, Iori Motoo, Seiko Narushima, Yuya Kiguchi, Keiko Yasuma, Eiichiro Watanabe, Takeshi Tanoue, Christoph A. Thaiss, Mayuko Sato, Kiminori Toyooka, Heba S. Said, Hirokazu Yamagami, Scott A. Rice, Dirk Gevers, Ryan C. Johnson, Julia A. Segre, Kong Chen, Jay K. Kolls, Eran Elinav, Hidetoshi Morita, Ramnik J. Xavier, Masahira Hattori & Kenya Honda. (2017). Ectopic colonization of oral bacteria in the intestine drives T_H1 cell induction and inflammation. Science 358, 359-365, doi: https:///10.1126/science.aan4526

13    Meriem Belheouane, Yask Gupta, Sven Künzel, Saleh Ibrahim & John F. Baines. (2017). Improved detection of gene-microbe interactions in the mouse skin microbiota using high-resolution QTL mapping of 16S rRNA transcripts. Microbiome 5, 59, doi: https:///10.1186/s40168-017-0275-5

14    Girish Srinivas, Steffen M?ller, Jun Wang, Sven Künzel, Detlef Zillikens, John F. Baines & Saleh M. Ibrahim. (2013). Genome-wide mapping of gene–microbiota interactions in susceptibility to autoimmune skin blistering. Nature Communications 4, 2462, doi: https:///10.1038/ncomms3462