8月25日，The Plant Cell 在線發(fā)表了比利時(shí)VIB-UGent植物系統(tǒng)生物學(xué)中心的Thomas B Jacobs教授的題為 CRISPR Screens in Plants: Approaches, Guidelines, and Future Prospects 的特邀綜述文章。CRISPR因組編輯技術(shù)大規(guī)模構(gòu)建突變體庫(kù)并進(jìn)行功能篩選是高效便捷獲得重要突變體和快速克隆對(duì)應(yīng)基因的有效方法，同時(shí)能夠?yàn)?/span>分子設(shè)計(jì)育種提供重要的供體材料。雖然該技術(shù)具有巨大的應(yīng)用潛力，但在植物中的應(yīng)用仍處于起步階段。本文討論了在植物中構(gòu)建CRISPR篩選系統(tǒng)的原理、工具和構(gòu)建流程；并討論了在植物中如何設(shè)計(jì)CRISPR基因敲除篩選系統(tǒng)及多項(xiàng)設(shè)計(jì)方案。最后，作者討論了CRISPR篩選系統(tǒng)對(duì)植物基因組中冗余基因功能研究的獨(dú)特能力，多篩選系統(tǒng)的組合使用有可能產(chǎn)生高效的突變集合，并有助于基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的挖掘。未來(lái)，通過(guò)將這種方法與過(guò)去二十年產(chǎn)生的大量基因組圖譜相結(jié)合，CRISPR 篩選技術(shù)的實(shí)施為分析植物基因組提供了更深層次分析的工具，并將導(dǎo)致功能生物學(xué)和合成生物學(xué)的巨大進(jìn)步。
首先，作者介紹了CRISPR基因編輯技術(shù)的原理和針對(duì)作物育種需求所開(kāi)發(fā)的應(yīng)用工具。
圖1：CRISPR-Cas 基因組編輯工具。(A)Cas9-gRNA復(fù)合物，復(fù)合物包含行使剪切功能的 Cas9 蛋白以及特異靶向基因組的 gRNA 。通過(guò) gRNA 序列與基因組序列的特異性匹配， Cas9 蛋白能在基因組特定位置行使剪切功能。在不完全的DNA修復(fù)之后，可以在目標(biāo)位點(diǎn)產(chǎn)生核苷酸缺失或插入。(B)通過(guò)將Cas9(D10A)(NCas9)或Cas9(D10A H840A)(dCas9)融合到胞苷或腺嘌呤脫氨酶結(jié)構(gòu)域來(lái)構(gòu)建堿基編輯器。胞苷堿基編輯分子(CBE)優(yōu)先引入C到T突變，而腺嘌呤堿基編輯分子(ABE)催化A到G突變。堿基編輯器在受限的編輯窗口中脫氨核苷酸(綠色核苷酸)。(C)CRISPR干擾(CRISPRi)或CRISPR激活(CRISPRa)，dCas9與轉(zhuǎn)錄抑制因子或激活結(jié)構(gòu)域融合，可以調(diào)節(jié)RNA水平。紅色三角形：核酸酶切割位點(diǎn)。D10A和H840A是使核酸酶域失活的Cas9突變。接著，作者通過(guò)對(duì)EMS-Tilling、T-DNA插入、人工RNAi、CRISPR等構(gòu)建的突變體庫(kù)的突變偏好性、隨機(jī)突變或靶向突變、脫靶率、突變?nèi)后w大小、候選基因分離的難易程度等特征進(jìn)行了比較，指出使用CRISPR進(jìn)行篩選的主要優(yōu)點(diǎn)在于它易于識(shí)別因果基因，并且特異性相對(duì)較高(表1）。此外，允許多個(gè)基因同時(shí)為靶點(diǎn)，因此可以克服基因冗余；并使用小得多的群體就能進(jìn)行飽和突變。最后，CRISPR 工具箱的多功能性使研究人員不僅能夠產(chǎn)生功能突變的插入和丟失，而且還能產(chǎn)生一系列基因組擾動(dòng)，例如特定的單核苷酸變體或轉(zhuǎn)錄變化，這是其他基因敲除技術(shù)所不能實(shí)現(xiàn)的。表1：植物遺傳篩選方法的比較分析 進(jìn)一步，作者分析了CRISPR篩選技術(shù)在植物中的應(yīng)用實(shí)例。在動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)內(nèi)，CRISPR篩選技術(shù)被廣泛用于正向遺傳學(xué)研究，而在植物中只報(bào)道了少數(shù)的幾個(gè)研究，主要集中在水稻、玉米、番茄、大豆的研究中。比如，在水稻中，構(gòu)建了CRISPR敲除突變體庫(kù)，每個(gè)載體是只含有一個(gè)gRNA的T-DNA，利用88,541個(gè)gRNAs和2~3個(gè)171gRNAs的文庫(kù)，對(duì)中花11水稻中基因組中的16934,234個(gè)非轉(zhuǎn)座元件(TE)蛋白編碼基因(約占全部基因的83%)進(jìn)行編輯，產(chǎn)生了一個(gè)91,004個(gè)個(gè)體的T0突變?nèi)后w，突變率約為80%(李家洋院士團(tuán)隊(duì)，2017年)。 表2：CRISPR篩選技術(shù)在植物中的應(yīng)用隨后，在分析了CRISPR篩選技術(shù)的當(dāng)前應(yīng)用之后，借鑒這些實(shí)例的方法和經(jīng)驗(yàn)，作者提出了進(jìn)行CRISPR敲除篩選技術(shù)所需要的設(shè)計(jì)準(zhǔn)則。分別從編輯工具的選擇、篩選方法的選擇、目標(biāo)數(shù)量、群體大小、誘變效率、代表性因子（代表在同一基因中應(yīng)該有突變的獨(dú)立品系的數(shù)量，以在關(guān)聯(lián)基因型和表型時(shí)提供可信度）、篩選的目標(biāo)位點(diǎn)、GRNA的文庫(kù)構(gòu)建策略、數(shù)據(jù)獲得和驗(yàn)證以揭示基因功能等幾個(gè)方面進(jìn)行了分析和討論，并提供了一般性的參考建議。植物CRISPR基因敲除篩選的工作流程和設(shè)計(jì)參數(shù)利用CRISPR篩選技術(shù)開(kāi)發(fā)植物gRNA預(yù)測(cè)工具利用CRISPR篩選對(duì)植物基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行定位和驗(yàn)證最后，作者對(duì)CRISPR系統(tǒng)在植物中的應(yīng)用進(jìn)行了展望。作者預(yù)計(jì)在不久的將來(lái)，進(jìn)行CRISPR篩查或訂購(gòu)CRISPR 文庫(kù)將變得與進(jìn)行EMS篩查或T-DNA/轉(zhuǎn)座子插入一樣常見(jiàn)。并重點(diǎn)介紹了當(dāng)前一些需要克服的限制。比如，1)對(duì)gRNA效率和編輯結(jié)果的預(yù)測(cè)工具開(kāi)發(fā)。gRNA是建立CRISPR實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵步驟，對(duì)CRISPR文庫(kù)的質(zhì)量有很大影響。具有更多活性的gRNA提高了系統(tǒng)的效率，并減少了必要群體的大小。然而，隨著gRNA數(shù)量的增加，這樣的預(yù)篩選變得不那么實(shí)用。因此，希望有一條流水線來(lái)選擇高活性的gRNA。預(yù)測(cè)在目標(biāo)位點(diǎn)產(chǎn)生的突變類型是gRNA設(shè)計(jì)的另一個(gè)重要要素。2)記錄單細(xì)胞水平的基因編輯結(jié)果;3)CRISPR技術(shù)的組合使用。比如，組合CRISPR遺傳篩選技術(shù)可同時(shí)靶向特定家族、調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)或感興趣的代謝途徑中的所有基因來(lái)實(shí)現(xiàn)多目的的要求。綜上所述，作者預(yù)計(jì)CRISPR遺傳篩選技術(shù)的發(fā)展將極大地加快植物功能遺傳學(xué)和合成生物學(xué)的步伐。文章鏈接：http://www./content/early/2020/08/25/tpc.20.00463
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