大家好，今天和大家分享的是19年發(fā)表在The Journal of Clinical Investigation雜志上的一篇關于腫瘤免疫微環(huán)境的文獻。標題的大致含義是“局部免疫環(huán)境能夠決定腫瘤PD-L1的異質(zhì)性，進而影響腫瘤對免疫治療的敏感性”。
在背景部分，作者指出：
PD-L1在難治性腫瘤的治療方面是一個很有潛力的靶點。然而，PD-L1+腫瘤的免疫環(huán)境及腫瘤的特點，以及它們影響治療效果的機制目前還不清楚。
在本項研究中，作者通過對32種腫瘤類型的9769名患者的基因數(shù)據(jù)進行分析，發(fā)現(xiàn)患者局部免疫情況可以決定PD-L1的異質(zhì)性與腫瘤生物特征，并進一步影響患者臨床結局。
接下來，是文章的結果總覽，文章大致可以分為表型、機制和藥物治療三部分：圖1和圖2對應表型部分，圖1說明PD-1與多種腫瘤的免疫特征相關，圖2 說明高表達PD-L1的腫瘤免疫環(huán)境決定了患者的臨床結局；圖3、4、5、6對應文章第二部分，闡述了腫瘤巨噬細胞和T細胞分別通過不同的途徑，誘導癌細胞PD-L1；圖7、8則對應文章的第三部分，圖7說明兩種不同方式誘導產(chǎn)生的PD-L1 +腫瘤細胞對免疫治療的反應不同，圖8說明免疫檢查點阻滯治療聯(lián)合NF-κB通路抑制能有效地抑制腫瘤生長。
接下來，是文章的數(shù)據(jù)部分：

圖1主要闡述的內(nèi)容是：PD-L1反映了人類多種腫瘤的免疫特征

圖A是對345名肝癌患者的PD-L1和IFN-γ相關性進行分析的結果。其中藍色代表PD-L1,紅色代表IFN-γ。以IFN-γ為例，可以看到隨著IFN-γ表達的升高，PD-L1表達并沒有隨之升高，反之亦然，從而說明高表達IFN-γ的組織并不伴隨PD-L1的高表達。
圖B是對TCGA數(shù)據(jù)庫32種腫瘤的9138名患者的RNA-seq數(shù)據(jù)進行分析，其中27種類型IFN-γ與PD-L1沒有相關性或為弱相關。
圖C是將32種癌癥樣本中的9138例患者按每種腫瘤內(nèi)PD-L1或IFN-γ表達的平均值分為兩組。發(fā)現(xiàn)只有極少部分的高表達PD-L1的樣本同時呈現(xiàn)IFN-γ高表達的特征

圖D是對來自TCGA數(shù)據(jù)集的肝癌樣本中進行分析，發(fā)現(xiàn)肝癌組織中有53種基因與PD-L1表達相關，進行GO分析發(fā)現(xiàn)4條富集程度較高的通路與腫瘤壞死因子或白介素-1特征相關（圖1D）
圖E是基因富集分析的結果，進一步證實了與IL-1和TNF特征相關的基因主要富集在PD-L1高表達的肝癌組織中

圖2主要闡述的內(nèi)容是：高表達PD-L1腫瘤的免疫微環(huán)境決定了患者的臨床結局

圖A是在TCGA的32種癌癥樣本中，分析了9138例患者PD-L1與相應基因之間的相關性。
其中巨噬細胞標記物CD68和T細胞標記物CD3基因與PD-L1存在相關性，說明PD-L1與巨噬細胞和T細胞的浸潤相關
圖B是分析肝癌組織中國巨噬細胞和T細胞密度與PD-L1表達的相關性?？梢钥吹骄奘杉毎颍ê停㏕細胞聚集在PD-L1高表達的腫瘤組織內(nèi)
圖C是肝癌組織中共聚焦顯微鏡分析，綠色代表PD-L1 +細胞、紅色代表CD68 +巨噬細胞和白色代表CD3 + T細胞
圖D反映的是結腸癌 (n = 82)、胃癌(n = 78)和肺腺癌 (n = 89)組織中PD-L1表達水平高低與巨噬細胞和T細胞的密度的關系。黑色代表PD-L1低表達，紅色代表PD-L1高表達
由此可得巨噬細胞、T細胞聚集在PD-L1高表達的腫瘤組織內(nèi)

圖F是單變量回歸分析說明巨噬細胞與T細胞比例是HCC侵襲性的獨立預測因子

圖E是左側圖根據(jù)PD-L1在腫瘤中的表達將276例HCC患者分為兩組:紅色，低表達黑色高表達，可以看到兩組在復發(fā)率上沒有明顯的區(qū)別;在右側圖中將138例CD274高表達患者按腫瘤中巨噬細胞與T細胞的比例進一步分為4組:橙色代表，比值值> 2,n = 39;綠線，比值介于1和2,n = 30;紫色線，比值介于0.5和1,n = 31;藍線，比值小于0.5，可以看到
患者的復發(fā)與PD-L1是否高表達并無關系，而與巨噬細胞和T細胞的浸潤比例有關，比值越高復發(fā)的可能性越大
圖H是在肺腺癌（LUAD）、腸腺癌（COAD）、胃腺癌（STAD）進行的重復驗證得到的結論與圖3E相同

根據(jù)腫瘤中巨噬細胞與CD3 + T細胞的比例將CD274例高級別患者分為4組
A圖顯示肝癌中四個組PD-L1表達差異，BCD分別顯示結腸癌、胃癌、肺腺癌中不同分組PD-L1表達差異。可以各組之間PD-L1表達水平無明顯差異，與正文圖2 E、H呼應，排除PD-L1表達水平對患者臨床結局的影響
圖3主要說明的是：腫瘤內(nèi)巨噬細胞和T細胞均能誘導PD-L1腫瘤細胞

圖A和B是在NOD/SCID(非肥胖糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷)小鼠接種25天前后，肝癌組織中PD-L1的表達觀察到在免疫缺陷環(huán)境下，PD-L1+的腫瘤細胞幾乎消失

圖C和圖D是對人類肝癌細胞系采用不同的培養(yǎng)條件培養(yǎng)，得出的結果
將肝癌細胞系細胞Hep3B、Huh7、HepG2暴露于腫瘤白細胞培養(yǎng)的條件培養(yǎng)基(CM)中，PD-L1快速上調(diào)，在3天內(nèi)達到最高值，移除CM后逐漸下降

圖E和圖F是用分為T細胞來源、巨噬細胞來源、B細胞來源等條件培養(yǎng)基分別處理腫瘤細胞后觀察癌細胞PD-L1表達，發(fā)現(xiàn)與正常培養(yǎng)相比，培養(yǎng)過T細胞的培養(yǎng)基（T-cell-CM）或肝癌來源的巨噬細胞的培養(yǎng)基（TAM-CM）能使腫瘤細胞在增殖時產(chǎn)生PD-L1表達的腫瘤細胞

圖4主要說明的是：巨噬細胞和T細胞誘導表達PD-L1腫瘤細胞的方式不同

圖A是未經(jīng)過處理、T細胞的培養(yǎng)基（T-cell-CM）處理、巨噬細胞的培養(yǎng)基處理后HepG2細胞蛋白表達情況
從中可以看到T-cell-CM能激活肝癌細胞表達STAT1；TAM-CM能強烈激活肝癌細胞表達STAT3。

圖B是加入抑制劑后的回復實驗結果，說明加入NF-κB通路抑制劑后巨噬細胞誘導PD-L1表達 下降,而阻斷STAT1信號通路T細胞誘導的PD-L1表達下降

圖C和圖D是對巨噬細胞和T細胞誘導表達PD-L1上游機制的研究，說明阻斷巨噬細胞分泌的TNF-α或IL-1β后，可以阻斷下游NF-κB通路的激活，抑制腫瘤PD-L1表達

圖E是PD-L1的 腫瘤細胞體外培養(yǎng)或在免疫功能正常的小鼠表達情況。
圖F和G是敲除 NF-κB通路中P65或阻斷IFN-γ受體表達后癌細胞中PD-L1的表達在腫瘤組織中的表達。

圖H和I是注射抗T細胞標記物CD3抗體和抗集落刺激因子1抗體后，腫瘤細胞PD-L1表達情況
這一部分說明腫瘤免疫微環(huán)境中，巨噬細胞分泌的TNF-α、IL-1β被腫瘤細胞表面相應受體識別，引起NF-κB通路激活，誘導PD-L1表達；T細胞分泌干擾素γ，與腫瘤細胞表面受體結合引起信號通路激活，誘導PD-L1表達。

圖5主要說明的是：巨噬細胞和T細胞誘導PD-L1 +癌細胞具有特異的腫瘤特征

圖A、B、C是對比了兩種來源的PD-L1陽性腫瘤細胞的凋亡、細胞遷移表型：圖A是在血清饑餓條件下腫瘤細胞中凋亡相關的蛋白的表達不同，圖B是凋亡細胞數(shù)目，說明T-cell-CM培養(yǎng)過的HepG2細胞在血清饑餓條件下更易凋亡；圖C對比腫瘤細胞遷移能力，說明TAM-CM處理過的HepG2細胞更易發(fā)生遷移；

圖D和圖E對比了腫瘤細胞上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化能力，說明巨噬細胞誘導的PD-L1 +肝癌細胞選擇性表達波形蛋白，E-鈣黏蛋白減少，更容易發(fā)生提示上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)

圖F是分析巨噬細胞誘導的PD-L1 陽性腫瘤細胞與未誘導的腫瘤細胞，致癌基因mRNA水平的變化，可以觀察到EFNA1、 ITGB3、EFNB2等生長因子及受體基因、IL8、THBS1、CDH5等粘附分子基因、TNFAIP2等蛋白酶、SPHK1、PTGS1等轉(zhuǎn)錄因子基因、TNF、IL6等細胞因子基因的mrna水平相對于未經(jīng)巨噬細胞處理的癌細胞含量升高

圖G是TCGA數(shù)據(jù)集肝癌樣本中巨噬細胞比T細胞比例高的樣本與比例低的樣本血管生成特征、轉(zhuǎn)移特征和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化基因富集分析。發(fā)現(xiàn)巨噬細胞誘導的PD-L1 +肝癌細胞中促血管生成、轉(zhuǎn)移、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化基因的表達上調(diào)，說明巨噬細胞賦予癌細胞生存、遷移和血管生成的能力。

接下來作者在TCGA數(shù)據(jù)集結腸癌、胃癌、肺腺癌樣本中進行重復驗證，CD68/CD3E高比例樣本中與血管生成特征、轉(zhuǎn)移特征和EMT樣特征的基因集富集，說明在高表達PD-L1的HCC、COAD、LUAD和STAD腫瘤中，EMT、轉(zhuǎn)移和血管生成的基因選擇性富集

圖6主要說明的是：巨噬細胞誘導產(chǎn)生的PD-L1腫瘤細胞通過NF-κB通路變得更具侵襲性

圖A是細胞遷移實驗，通過添加通路阻斷劑和rna干擾下調(diào)P65表達后，觀察肝癌細胞遷移能力，其中siNC組作為rna干擾的陰性對照組，DMSO作為藥物溶劑，設置該組作為對照
圖B是經(jīng)過圖A處理后，觀察與上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化相關的基因轉(zhuǎn)錄水平改變
圖A、B說明通過抑制NF-κB通路或抑制P65表達后肝癌細胞的遷移下降和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化表型受到抑制

圖C是癌細胞接觸腫瘤壞死因子α和白介素1β后觀察STAT1通路和NF-κB通路蛋白磷酸化改變，可以觀察到癌細胞接觸壞死因子α和白介素1β后，p65發(fā)生磷酸化；接觸干擾素γ后，stat1發(fā)生磷酸化
圖D是免疫熒光實驗，可以觀察到癌細胞接觸腫瘤壞死因子α和白介素1β后細胞核內(nèi)出現(xiàn)P65代表的紅色，說明發(fā)生P65入核，進一步說明NF-κB通路被激活
圖C和D說明癌細胞接觸TNF-α和IL-1β后，激活NF-κB通路，導致肝癌細胞的遷移和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化能力增強
圖E、F、G與圖A、B設置類似，說明的是癌細胞接觸TNF-α和IL-1β后，遷移增強和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化能力增強

圖7主要說明的是：不同方式誘導產(chǎn)生的PD-L1+的腫瘤細胞對治療的反應不同

圖A對比腫瘤細胞對阿霉素反應，可以看到同等藥物濃度下，巨噬細胞誘導的PD-L1陽性腫瘤細胞凋亡程度最低，而圖B、C中通過抑制NF-κB通路或調(diào)低P65 NF-κB亞基表達則能提高凋亡細胞的比例

圖E對比腫瘤細胞對T細胞殺傷作用的抵抗能力，我們用直接從小鼠Hepa1-6肝癌中分離的CD8 + T細胞培養(yǎng)這些細胞。未經(jīng)過巨噬細胞誘導處理的腫瘤細胞與CD8 + T細胞接觸3至6小時后，被殺滅。轉(zhuǎn)染PD-L1的Hepa1-6細胞可以部分抵抗T細胞的細胞毒性，但這個過程通過抗PD-L1抗體而被阻斷。巨噬細胞誘導產(chǎn)生的PD-L1 +肝癌細胞能抵抗 T細胞的細胞毒性

圖F和圖G是檢測與腫瘤細胞接觸后CD8 + T細胞的功能狀態(tài)。圖F說明T細胞接觸三種不同途徑產(chǎn)生的PD-L1陽性腫瘤細胞后IFN-γ 、IL-2水平相當，圖G顯示T細胞標志物CD107a表達。兩圖共同說明巨噬細胞生成的PD-L1 +肝癌細胞對T細胞的細胞毒性具有抵抗能力，但不抑制CD8 + T細胞的功能。

圖8主要說明的是：抑制巨噬細胞激發(fā)NF-κB通路能提高免疫檢查點抑制劑的阻滯效果

圖A和B探究的是巨噬細胞產(chǎn)生的PD-L1+腫瘤細胞對免疫治療產(chǎn)生的影響，將 PD-L1陽性鼠源性肝癌細胞接種到老鼠肝臟，使用抗PD-L1抗體，抗巨噬細胞標記物抗體處理，分析腫瘤大小，結果發(fā)現(xiàn)抗PD-L1抗體聯(lián)合巨噬細胞清除能有效抑制腫瘤組織的增殖（圖10A和10B）。
圖C和圖D與A、B設計類似，說明抗PD-L1抗體聯(lián)合抑制P65表達，能起到同樣的抑制效果。

補充材料中，黑色素瘤接種小鼠背組織后經(jīng)過抗CSF1R ,αPD-L1 或αCSF1R Ab +αPD-L1 Ab處理后，觀察腫瘤體積大小，圖B是經(jīng)過處理后腫瘤大小，可以看到免疫檢查點阻滯治療聯(lián)合體內(nèi)巨噬細胞清除能有效地抑制腫瘤生長

圖E、F說明的是肝癌、肺腺癌（LUAD）、腸腺癌（COAD）、胃腺癌（STAD）中巨噬細胞標記物CD68與NF-κB 通路活化、腫瘤復發(fā)正相關， 因此通過抑制巨噬細胞在腫瘤細胞中的浸潤或抑制NF-κB信號，可以增強免疫檢查點的治療效果

主要結論

由巨噬細胞促炎反應導致NF-κB信號通路激活產(chǎn)生的PD-L1+腫瘤細胞表現(xiàn)出侵襲性生存、促血管生成、轉(zhuǎn)移等特點
由激活T細胞所產(chǎn)生的STAT1信號則會導致PD-L1+腫瘤細胞的凋亡。
由此導致的重要結果是，由巨噬細胞所建立的PD-L1+腫瘤細胞對傳統(tǒng)化療、腫瘤特異的效應T細胞的細胞毒性作用、免疫檢查點阻滯療法效果不佳。
而免疫檢查點阻滯治療聯(lián)合體內(nèi)巨噬細胞清除（或NF-κB通路抑制）能有效地抑制腫瘤。
本研究揭示了PD-L1+腫瘤的功能特點，并提示對炎癥細胞的功能活動施加影響能提高腫瘤檢查點阻滯療法的療效。