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編譯：王一，編輯：Emma、江舜堯。
背景：高膽固醇血癥和高循環(huán)膽固醇與心血管疾?。–VD）的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，而CVD導(dǎo)致的死亡占現(xiàn)代工業(yè)化國家死亡人口總數(shù)的四分之一。膽固醇的血清濃度受其兩個(gè)主要來源影響：肝臟中合成的內(nèi)源性膽固醇和飲食成分中動物來源的外源性膽固醇（圖1），它們會分泌至小腸并最終進(jìn)入血漿。人們在闡明腸道微生物的膽固醇代謝是如何影響血清膽固醇水平這一問題上已有100多年歷史。前人工作表明，進(jìn)行飲食干預(yù)或他汀類藥物干預(yù)能影響腸道膽固醇水平，依替米貝(Ezetimibe)（FDA批準(zhǔn)的腸道膽固醇吸收抑制劑）的使用能抑制腸道吸收膽固醇。腸道微生物對膽固醇的代謝也會減少腸道對膽固醇的吸收，進(jìn)而降低血清膽固醇水平（圖1）。這些腸道細(xì)菌是通過間接還原途徑將膽固醇代謝為糞甾醇的，該途徑涉及到膽固醇(1)被初始氧化為膽甾烯酮(2)，進(jìn)而Δ4,5雙鍵還原成糞甾烷酮(3)，隨后再還原酮生成糞甾醇(4)（圖1）。但對于腸道微生物，基因和催化糞甾醇形成的特異酶的了解相當(dāng)有限，因此對這一關(guān)聯(lián)性的機(jī)制探索仍然遙遙無期。
方法優(yōu)勢與創(chuàng)新：本研究的一大看點(diǎn)是對微生物組學(xué)數(shù)據(jù)的深度分析和挖掘策略。研究人員重點(diǎn)關(guān)注了腸道菌群能將膽固醇轉(zhuǎn)化為不易吸收的糞甾醇的特性，進(jìn)而開發(fā)出一種能鑒定功能酶和功能微生物的多學(xué)科框架流程，能夠從一類未培養(yǎng)的腸道細(xì)菌群體中鑒定和表征廣泛的膽固醇脫氫酶家族，這類腸道細(xì)菌能夠在胃腸道中介導(dǎo)膽固醇代謝為糞甾醇。通過將現(xiàn)有群體的宏基因組和代謝組學(xué)關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)與生化實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)相結(jié)合進(jìn)行充分分析挖掘。這種挖掘策略也可應(yīng)用于其他有趣的途徑或代謝物中，無論涉及該代謝的微生物是什么，都能進(jìn)一步鑒定和表征微生物群主導(dǎo)生物過程中涉及的酶，這對于微生物組研究尤其重要。
原名：Cholesterol Metabolism by Uncultured Human Gut Bacteria In?uences Host
Cholesterol Level 譯名：未培養(yǎng)的人體腸道細(xì)菌的膽固醇代謝影響宿主膽固醇水平
期刊：Cell Host & Microbe
IF：15.923 發(fā)表時(shí)間：2020.08 通訊作者：Emily P. Balskus& Ramnik J. Xavier
通訊作者單位：博德研究所 1. 人類腸道微生物組中假定的膽固醇代謝酶鑒定 首先通過分析腸道微生物組找到與糞便代謝組中糞甾醇有關(guān)聯(lián)的酶編碼基因。從不同地理位置搜集了腸道微生物組數(shù)據(jù)集（n = 3,097）并進(jìn)行從頭組裝，產(chǎn)生了5,929,528個(gè)非冗余完整基因。為了將具有相似分子功能的蛋白質(zhì)聯(lián)系起來，更好地綜合分析糞便代謝組學(xué)數(shù)據(jù)，將這些基因分組為同源蛋白質(zhì)簇（基于序列的同源性，最低限50％ aa），能將具有相似分子功能但序列不同的蛋白質(zhì)有效地歸為一組，隨后對來自兩個(gè)獨(dú)立數(shù)據(jù)集共625個(gè)樣品的糞便宏基因組學(xué)和代謝組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行匹配。為找到與腸道糞甾醇產(chǎn)生有關(guān)的蛋白，將這些樣本中同源蛋白簇與糞甾醇進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析（圖2A），衍生出反映相關(guān)性強(qiáng)弱的指標(biāo)：敏感性和特異性，能反映該蛋白簇與糞甾醇檢測之間的密切程度。經(jīng)過對指標(biāo)的調(diào)整，對蛋白質(zhì)簇的指標(biāo)調(diào)整為敏感性> 0.3和特異性> 0.9，將有希望找到與糞甾醇相關(guān)性強(qiáng)的蛋白質(zhì)簇，并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。為鑒定最有可能包含膽固醇代謝酶的蛋白質(zhì)簇，研究人員整合了先前報(bào)道的相關(guān)細(xì)菌基因組信息。其中，20世紀(jì)從養(yǎng)豬污水中分離到的E.coprostanoligenes HL (ATCC 51222)菌株效果最好，對該菌進(jìn)行了測序并組裝出高質(zhì)量的全基因組，以驗(yàn)證糞甾醇的形成過程。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)該菌株約80%的蛋白質(zhì)能比對到上文中組裝的同源蛋白簇上（50％aa相似性），這些蛋白中有328個(gè)在糞甾醇檢測中的指標(biāo)達(dá)到敏感性> 0.3，特異性> 0.9（圖 2B）。通過整合篩選結(jié)果和菌株基因組信息，大大縮小了尋找參與膽固醇代謝的候選酶的范圍。假設(shè)E.coprostanoligenes的未知膽固醇代謝酶與生成糞甾醇的人類腸道微生物酶是有關(guān)系的，那么接下來對該菌株是如何完成糞甾醇生成這一過程進(jìn)行研究。早期研究表明，E.coprostanoligenes體內(nèi)的糞甾醇的形成途徑涉及膽固醇（1）最初氧化為膽甾烯酮。據(jù)此，研究人員分別在有氧和無氧條件下測試了該菌株裂解物對膽固醇的反應(yīng)活性，發(fā)現(xiàn)膽固醇確實(shí)能轉(zhuǎn)化為膽甾烯酮，且該反應(yīng)需要NADP ，且不依賴氧。而該途徑的假定的第二步是從膽甾烯酮（2）生成糞甾烷酮（3），在本研究的驗(yàn)證試驗(yàn)中并未檢測到這一步反應(yīng)。這表明測定條件需要進(jìn)一步優(yōu)化，或者假定的酶在細(xì)胞裂解過程中會失活。因此，研究人員首先考慮了膽固醇氧化酶作為膽固醇代謝酶的可能性。腸道屬于厭氧環(huán)境，該菌株細(xì)胞裂解液中的膽固醇氧化與氧氣無關(guān)，所以先排除掉氧依賴性的酶。那么能夠以不依賴氧為特征進(jìn)行此反應(yīng)的酶還剩土壤脫細(xì)菌斯特氏桿菌（Sterolibacteriumdenitri?cans）的膽固醇脫氫酶AcmA（PF01370）和結(jié)核分枝桿菌（Mycobacteriumtuberculosis）的Rv1106c。有趣的是，這兩個(gè)酶在人類微生物組基因目錄中有大量同系物，將這些同系物匹配到研究人員的兩個(gè)代謝組學(xué)數(shù)據(jù)集中，對糞甾醇均不具有很高的特異性和敏感性（圖2C）。因此，研究人員考慮的最后一類酶是羥基類固醇脫氫酶（HSD），它屬于短鏈脫氫酶（SDR）家族（PF00106）。這些酶在許多腸道微生物中都有，以NAD（P） 依賴性，氧依賴性的方式將膽汁酸的羥基氧化為酮。進(jìn)行比對分析后發(fā)現(xiàn)，HSD簇中的四個(gè)簇含有E. coprostanoligenes蛋白的同系物，包括25個(gè)與糞便中糞甾醇形成有關(guān)的蛋白，其特異性指標(biāo)為0.92，敏感性指標(biāo)為0.68（圖2D）?？傊?，宏基因組挖掘結(jié)合代謝組學(xué)，基因組和酶指向的生物信息學(xué)分析，將6M微生物組基因濃縮至4個(gè)蛋白質(zhì)簇，對其優(yōu)先順序進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。
圖1 血清膽固醇水平對人類健康很重要，可由多種因素調(diào)節(jié)，包括腸道菌群對膽固醇的潛在代謝
圖2 人類糞便宏基因組，代謝組，菌株全基因組和酶功能綜合分析揭示了人類腸道微生物組中參與膽固醇代謝的候選細(xì)菌基因
2. 假定的腸道微生物膽固醇脫氫酶的生化特征 為了測試上文中優(yōu)化得來的蛋白簇是否可以將膽固醇（1）氧化為膽甾烯酮（2），在大腸桿菌中表達(dá)了由E.coprostanoligenes編碼的四個(gè)擬定的HSD，并評估其細(xì)胞裂解液對膽固醇的反應(yīng)活性（圖3A）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)糞便代謝組中對糞甾醇具有最高特異性的E.coprostanoligenes HSD酶是ECOP170（WP_078769004.1），能將膽固醇氧化為膽甾烯酮，完成膽固醇代謝的第一步。同時(shí)，ECOP170還可以催化糞甾醇（4）氧化為糞甾烷酮（3），但不具有轉(zhuǎn)化初級膽汁酸類膽酸和鵝去氧膽酸的能力，表明ECOP170可能在此途徑的第一步（膽固醇氧化為膽甾烯酮）和最后一步（將糞甾醇還原為膽固醇）均起特定作用（圖3B，3C）。通過qPCR測定ECOP170基因在菌株培養(yǎng)物中的表達(dá)水平并將其輔因子偏好性與菌株裂解物中的活性相匹配，證實(shí)了ECOP170在膽固醇代謝中的作用。為了確認(rèn)ECOP170基因確實(shí)是在代謝膽固醇的過程中特異表達(dá)，分別在含與不含膽固醇的培養(yǎng)條件下，檢測四個(gè)HSD的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平。培養(yǎng)2天后，與不含膽固醇的培養(yǎng)基相比，在這四個(gè)基因中，ECOP170在含膽固醇的培養(yǎng)基中高表達(dá)上調(diào)（增加28.9倍），這表明ECOP170確實(shí)是在代謝膽固醇的過程中被高度誘導(dǎo)表達(dá)。為了確定ECOP170的輔助因子偏好性是否與在E. Coprostanoligenes裂解物中觀察到的活性匹配，純化了帶有N端His6-tagged的ECOP170并對其活性進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)ECOP170對NADP 有絕對依賴性，對NAD 則無，與在E. coprostanoligenes裂解物中觀察到的活性一致。這些數(shù)據(jù)表明，E.Coprostanoligenes中的ECOP170酶能將膽固醇代謝成膽甾烯酮。借助此信息，用ECOP170 ismA來表示膽固醇轉(zhuǎn)化為糞甾醇過程中起特異作用的階段和行為。確定IsmA是膽固醇脫氫酶后，再次比對人類微生物組基因目錄，找到了含IsmA蛋白簇中的其他蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)也都有近乎完美的特異性指標(biāo)，但敏感性指標(biāo)要低很多，這表明在開始時(shí)將蛋白質(zhì)序列進(jìn)行分組按優(yōu)先度排序的有效性。在該蛋白簇中的25種蛋白質(zhì)序列中，有10種能在NCBI數(shù)據(jù)庫中找到，但都來自不可培養(yǎng)細(xì)菌的數(shù)據(jù)，且僅限于腸道微生物組組裝中鑒定到的微生物物種。此外，這10種蛋白質(zhì)以及其他15種蛋白質(zhì)都比對不到NCBI數(shù)據(jù)庫中的分離菌株或最近的腸道菌群分離菌株。由上文得出，目前尚無可編碼任何IsmA同系物的人類腸道微生物分離菌株，因此研究人員選擇了六種不同序列的同系物，用于大腸桿菌中的異源表達(dá)和體外生化表征。這六個(gè)IsmA同系物在大腸桿菌裂解物中均可將膽固醇氧化為膽甾烯酮，并將糞甾醇氧化為糞甾烷酮。對含IsmA蛋白簇中25個(gè)蛋白質(zhì)序列進(jìn)行多序列比對，發(fā)現(xiàn)嚴(yán)格保守的Ser-Tyr-Lys催化三聯(lián)體結(jié)構(gòu)是HSD發(fā)揮催化活性所必需的，三聯(lián)體中任何一個(gè)氨基酸突變都會導(dǎo)致裂解物中膽固醇氧化活性的完全喪失。這些數(shù)據(jù)表明，在未培養(yǎng)的人類腸道細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的IsmA的同系物也是膽固醇脫氫酶，該酶參與人類腸道菌群中糞甾醇代謝的第一步和最后一步（圖1）。
圖3 E. coprostanoligenes和系統(tǒng)發(fā)生地人類相關(guān)細(xì)菌的未鑒定3β-羥基類固醇脫氫酶將膽固醇氧化為膽甾烯酮
3. 腸道微生物膽固醇脫氫酶是由一支與cluster IV梭菌相關(guān)的，常見卻不可培養(yǎng)微生物編碼合成的 由于在人類微生物組中發(fā)現(xiàn)的這25個(gè)ismA基因無法比對到任何公開可用的分離菌株基因組上，但其中的10個(gè)與宏基因組中組裝的物種有關(guān)，因此想進(jìn)一步確定其他15個(gè)ismA基因是否也能匹配到未培養(yǎng)的微生物物種上。為此，使用MSPminer將組裝好的人類腸道宏基因組分類為宏基因組物種（MSPs），并在這些物種中搜索25個(gè)ismA基因。最終有19個(gè)成功匹配到MSPs上，將這些MSPs與全范圍搜集到的可培養(yǎng)菌株在種水平上進(jìn)行相似性分類注釋，但并未成功，這就表明人類腸道的膽固醇代謝細(xì)菌之前并未被表征。為了輔助分類學(xué)注釋，使用一組單拷貝標(biāo)記基因評估了所有檢測到的MSPs與已分離到的微生物的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。在細(xì)菌的生命樹中，編碼IsmA的MSPs和E. coprostanoligenes形成一個(gè)連貫的進(jìn)化枝，位于梭菌聚類群Cluster IV的鄰近發(fā)育枝上。Cluster IV包括Faecalibacterium prausnitzii，Clostridium Leptum和瘤胃球菌屬（Ruminococcus bromii）（圖4A），其代謝功能與宿主的健康有關(guān)，比如短鏈脂肪酸的產(chǎn)生。在編碼IsmA的MSPs的鄰近區(qū)域中，有另外9個(gè)MSPs。對其基因組草圖進(jìn)行高質(zhì)量組裝進(jìn)行分析后，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)新的編碼ismA基因的MSPs（msp_0910和msp_0832），將其添加到進(jìn)一步的分析流程中。來自msp_0832的ismA基因在非冗余基因目錄的原始裝配中丟失，這表明通過采用不同的裝配技術(shù)可能會發(fā)現(xiàn)編碼IsmA的其他物種。對大多數(shù)編碼IsmA的MSPs生成高質(zhì)量的基因組草圖（完整性> 90％，污染<5％），全基因組相似性比較分析發(fā)現(xiàn)這些MSPs屬于不同物種，其最大平均核苷酸相似性為88％。隨后將編碼IsmA的MSPs的高質(zhì)量基因組與先前從人類腸道宏基因組中組裝的新MSPs進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)除了兩個(gè)物種外，其他物種均已在早期報(bào)道中進(jìn)行過分類。為擴(kuò)大最初的組裝覆蓋度以更好的搜尋IsmA蛋白，將其他報(bào)道中微生物組的數(shù)據(jù)集也納入分析中，又鑒定到另外14種IsmA蛋白（50％aa閾值）及其相應(yīng)的宏基因組組裝物種。值得注意的是，當(dāng)使用常用的基于參考微生物組的分析軟件（MetaPhlAn2，MetaPhlAn3和m OTUs_v2）來分析編碼IsmA的基因組時(shí)，僅匹配到少于四分之一的物種，這說明當(dāng)前基于參考微生物組分析的局限性。由于缺乏合成糞甾醇的人類腸道分離菌株，研究人員想測試含有編碼IsmA的物種的微生物群落是否可以體外合成糞甾醇。為此，在含膽固醇的培養(yǎng)基中對八名健康供體的糞便樣本進(jìn)行厭氧培養(yǎng)4天，在第3天進(jìn)行宏基因組測序，在第2天和第4天測定膽固醇，膽甾酮和糞甾醇水平。在第4天生成糞甾醇的四個(gè)樣品中檢測到了編碼IsmA的細(xì)菌，而不生成糞甾醇的樣品中則缺少編碼IsmA的細(xì)菌，這進(jìn)一步將復(fù)雜微生物群落中編碼IsmA的細(xì)菌與膽固醇代謝聯(lián)系在一起（圖4B）。雖然沒有觀察到膽固醇到糞甾醇的完全轉(zhuǎn)化過程，但糞便培養(yǎng)物與E. coprostanoligenes的無菌培養(yǎng)物中糞甾醇的含量水平相當(dāng)，表明在這些特定培養(yǎng)條件限制了其代謝轉(zhuǎn)化。為了解20種編碼IsmA物種在人體腸道中的分布，嚴(yán)格按照非冗余基因目錄對宏基因組數(shù)據(jù)集進(jìn)行了比對，以計(jì)算每個(gè)數(shù)據(jù)集中各個(gè)物種的普遍性和相對豐度。在用于最初組裝的六個(gè)隊(duì)列數(shù)據(jù)中，編碼IsmA物種的平均相對豐度僅為1.4％，而人類微生物組計(jì)劃2（HMP2）中包含編碼IsmA物種的樣品百分比為37％， CVON隊(duì)列中占92％（圖4C）。占比最低的兩個(gè)隊(duì)列是PRISM和HMP2，這兩個(gè)隊(duì)列包含來自炎癥性腸?。↖BD）患者的大量樣本。在這兩個(gè)IBD隊(duì)列中，克羅恩病與編碼IsmA物種的豐度下降顯著相關(guān)，表明這些編碼IsmA細(xì)菌可能對回腸末端炎癥敏感（圖4D）。在所有六個(gè)隊(duì)列數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)的MSPs都可以編碼在體外實(shí)驗(yàn)表征的IsmA同系物（圖4C）；msp_0205，msp_0238和msp_0196也存在于生成糞甾醇的糞便培養(yǎng)物中（圖4B）?？傊?，這些數(shù)據(jù)支持以下觀點(diǎn)，編碼IsmA的細(xì)菌是人類腸道微生物組的普遍組成部分，它們將膽固醇轉(zhuǎn)換為糞甾醇。
圖4 編碼膽固醇脫氫酶的腸道細(xì)菌是Cluster IV梭菌的未培養(yǎng)成員，在地理上的差異人群中普遍存在 4. 編碼IsmA細(xì)菌與糞便膽固醇含量的降低和糞便膽甾烯酮和糞甾醇水平升高有關(guān) 在完成對編碼IsmA細(xì)菌的普查后，進(jìn)一步評估這些細(xì)菌在復(fù)雜微生物群落中的存在與體內(nèi)糞甾醇形成的相關(guān)程度（圖5A）?；氐骄哂谐蓪Φ暮昊蚪M學(xué)和代謝組學(xué)數(shù)據(jù)的兩個(gè)獨(dú)立隊(duì)列，根據(jù)其糞便代謝組中是否含有糞甾醇，將樣品歸類為糞甾醇陽性（轉(zhuǎn)化者）和糞甾醇陰性（非轉(zhuǎn)化者）。在這兩個(gè)隊(duì)列中，轉(zhuǎn)化者樣品均富含編碼IsmA物種（圖5B），支持以下假設(shè)：腸道微生物組中又編碼IsmA細(xì)菌，能使群落將膽固醇代謝為糞甾醇。有趣的是，在沒有編碼IsmA細(xì)菌的微生物群落子集中，也發(fā)現(xiàn)了糞甾醇生成（圖5B）?？赡苁怯捎诤昊蚪M測序的檢測限導(dǎo)致的這一結(jié)果，尤其是微生物處于低豐度情況，或者其他更遠(yuǎn)進(jìn)化距離的相關(guān)微生物的膽固醇脫氫酶也參與了這一代謝反應(yīng)。除了編碼IsmA細(xì)菌與糞甾醇有關(guān)，還評估了編碼IsmA細(xì)菌是否與糞便膽固醇和非靶向代謝組學(xué)數(shù)據(jù)集中鑒定的代謝中間體的水平相關(guān)。令人驚訝的是，在PRISM和HMP2隊(duì)列中，編碼IsmA物種的糞便膽固醇降低了75％，而非編碼物種的糞便膽固醇降低了55％（圖5C）。而糞便中膽甾烯酮的水平相應(yīng)增加，在這兩個(gè)隊(duì)列中，IsmA編碼物種的膽甾烯酮含量分別為非編碼物種的5.4和3.3倍（圖5C）。這些代謝物水平的變化及其與ismA同系物的共現(xiàn)性與之前的假設(shè)一致，即編碼IsmA的腸道細(xì)菌會通過將膽固醇氧化為膽甾烯酮而消耗腸道內(nèi)的膽固醇，而膽甾烯酮是一種在糞甾醇形成過程中的中間體。為了確定其中形成糞甾醇的糞便樣品中膽固醇代謝的程度，使用定量液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）方法按PRISM隊(duì)列重新采集了26個(gè)樣品子集。實(shí)驗(yàn)測定的三種代謝物（膽固醇，膽甾烯酮和糞甾醇）的濃度值與之前測定的數(shù)據(jù)的相對豐度有很好的相關(guān)性，從而定量驗(yàn)證了糞便代謝組學(xué)數(shù)據(jù)中我們感興趣的代謝物。使用糞便樣本中每種化合物的絕對濃度，計(jì)算出每種樣本中糞甾醇，膽甾烯酮和膽固醇的相對比例（圖5C）。在11種含糞甾醇的人糞便樣品中，糞甾醇在總膽固醇和膽固醇代謝產(chǎn)物（膽固醇，膽甾烯酮和糞甾醇）中占比為7.4％至95.6％，表明體內(nèi)具有廣泛的這一些列代謝活性（圖5C）。這11個(gè)樣品中有7個(gè)樣品的糞甾醇占膽固醇代謝產(chǎn)物的50％以上。在這7個(gè)樣品中有3個(gè)樣品的糞甾醇占膽固醇代謝產(chǎn)物的90％以上。這些數(shù)據(jù)表明，在某些人中，該途徑可能在體內(nèi)將大多數(shù)腸道膽固醇轉(zhuǎn)化為糞甾醇。
圖5 糞便中糞甾醇形成與腸道微生物群中膽固醇脫氫酶有關(guān)
5. 編碼IsmA細(xì)菌與低血清膽固醇水平有關(guān) 因?yàn)榫幋aIsmA細(xì)菌與人類糞便樣本中的糞甾醇形成和糞便膽固醇水平降低都高度相關(guān)，所以研究人員接下來檢驗(yàn)了這些生成糞甾醇的細(xì)菌是否與人群中血脂水平的變化有關(guān)，特別是高密度脂蛋白（HDL）-C，低密度脂蛋白（LDL）-C和總膽固醇（TC）這些指標(biāo)。研究人員使用了來自三個(gè)國家的三項(xiàng)研究中配對的糞便宏基因組學(xué)和血清膽固醇測定結(jié)果。其中CVON（n = 292）和Jie等人的研究（n = 384）已發(fā)表見刊，而FHS隊(duì)列研究中623名受試者的糞便宏基因組學(xué)數(shù)據(jù)是由作者實(shí)驗(yàn)室提供。選定的研究中包括患有CVD的受試者。微生物組中的任何已知的編碼IsmA細(xì)菌的參與者被分類為編碼者，而沒有這些物種的參與者被視為非編碼者。對以上三項(xiàng)研究進(jìn)行meta分析，雖然LDL-C或HDL-C均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異，但在編碼者和非編碼者之間-0.15 mmol/L水平的TC有差異（95％CI：-0.27，-0.03）（圖6）。在所有三個(gè)研究中均具有方向一致性，且異質(zhì)性較低（I2 = 0）。關(guān)于編碼IsmA的細(xì)菌對血清膽固醇水平下降的作用幅度，分析發(fā)現(xiàn)編碼IsmA的細(xì)菌（TC濃度為0.15 mmol/L）的作用幅度略微超過了與脂質(zhì)相關(guān)的宿主基因（如HMGCR和PCSK9）的最大作用。由于這些編碼IsmA細(xì)菌的存在與血清總膽固醇水平的降低在生物學(xué)意義上顯著相關(guān)，因此表明人腸道微生物群的膽固醇代謝會降低宿主膽固醇水平。
圖6 Meta分析揭示了CVD人群中總膽固醇水平與編碼IsmA細(xì)菌狀態(tài)有關(guān)
早在100多年前就有前輩提出過腸道細(xì)菌將膽固醇代謝為糞甾醇可能會降低血清膽固醇水平的想法，但對此深入研究相對較少。與其他腸道微生物代謝活動（例如次級膽汁酸形成和短鏈脂肪酸生物合成）已有大量的研究資訊報(bào)道相比，有關(guān)膽固醇代謝的研究報(bào)道仍特別缺乏。由于難以在人類中培養(yǎng)參與該代謝活動的微生物，且缺乏有關(guān)該代謝過程的生化和遺傳基礎(chǔ)信息，阻礙了人們對腸道細(xì)菌膽固醇代謝生物學(xué)意義的理解。通過大規(guī)模的測序工作，無參考基因組的微生物組分析，以及一套基于體外生化和培養(yǎng)的分析方法，本報(bào)道中研究人員鑒定表征了催化糞甾醇生成的第一步和最后一步的腸道細(xì)菌酶。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同人群中大多數(shù)糞甾醇的生成可歸因于高度普遍的，編碼IsmA的細(xì)菌種類。這些物種以前沒有進(jìn)行表征且當(dāng)前還不能進(jìn)行分離培養(yǎng)，這也是為何一直以來對該代謝途徑難以深入研究的主要原因。此外，研究人員還發(fā)現(xiàn)糞便樣品中糞甾醇形成細(xì)菌與糞便膽固醇水平降低顯著有關(guān)，這為該類細(xì)菌能夠降低宿主血清膽固醇水平提供了可能的有效機(jī)制。同時(shí)對三個(gè)地理上差異的人類隊(duì)列數(shù)據(jù)進(jìn)行meta分析后得出的結(jié)果與上述發(fā)現(xiàn)也不謀而合，meta分析結(jié)果還表明，腸道菌群中有生成糞甾醇微生物的受試者的總血清膽固醇水平較低。 編碼IsmA細(xì)菌除了與血清脂質(zhì)水平變化有關(guān)外，還與腸道膽甾烯酮和糞甾醇水平升高有關(guān)。出現(xiàn)這一結(jié)果值得進(jìn)一步深入研究，因?yàn)檫@些分子對宿主的影響仍知之甚少。像膽汁酸這樣與膽固醇一系列代謝物具有相似化學(xué)結(jié)構(gòu)的代謝物，對宿主的代謝和免疫調(diào)節(jié)有很大的影響，因此，膽甾烯酮和糞甾醇都也可能影響宿主的生物學(xué)特征。該研究中針對哪種腸道細(xì)菌會參與此反應(yīng)這一問題，新開發(fā)出的分析流程將很好的指導(dǎo)腸道宏基因組數(shù)據(jù)集的分析，以識別腸道膽固醇代謝在其他生物學(xué)現(xiàn)象中發(fā)揮的作用。更普遍地說，這項(xiàng)工作強(qiáng)調(diào)將腸道微生物的代謝活動與生物體，基因和酶聯(lián)系起來，以充分了解與人宿主之間的代謝相互作用的迫切需要。 編碼IsmA細(xì)菌對血清膽固醇的影響大小與與人類基因差異引起的影響大小相當(dāng)，這表明這些細(xì)菌在CVD中具有潛在的保護(hù)作用，正如在人類基因變異型所觀察到的那樣。由于該研究目前的研究隊(duì)列在統(tǒng)計(jì)學(xué)上不足以評估CVD風(fēng)險(xiǎn)與腸道微生物組組成之間的聯(lián)系，因此急需進(jìn)行大規(guī)模的前瞻性研究來探索這一聯(lián)系。但是，通過對這些人類基因進(jìn)行治療性靶向干預(yù)會產(chǎn)生較大的效應(yīng)（針對HMGCR的他汀類靶向藥物：平均TC濃度為1.20 mmol/L），因此靶向調(diào)節(jié)這種微生物途徑的反應(yīng)活性也可能導(dǎo)致相似的效應(yīng)或額外的治療效果。通過將可代謝膽固醇的腸道細(xì)菌引入人體腸道菌群，或通過增加相應(yīng)益生元的含量，有可能實(shí)現(xiàn)對宿主血清膽固醇的靶向調(diào)節(jié)作用，這一治療策略有望影響人類代謝活動的其他領(lǐng)域。 利用整合高通量測序（從頭基因組裝和代謝組學(xué)）和生化知識的多學(xué)科策略，找到了腸道微生物組中參與膽固醇代謝的酶。這種相似的挖掘策略也可應(yīng)用于其他有趣的途徑或代謝物中，且無論涉及該代謝的微生物是什么，都能進(jìn)一步鑒定和表征微生物群主導(dǎo)生物過程中涉及的酶。這對于微生物組研究尤其重要，因?yàn)橛?jì)算分析方法的更新正在不斷揭示出全球微生物群落中還未表征的微生物和酶。盡管表征“微生物暗物質(zhì)”仍然面臨巨大挑戰(zhàn)，但將生物信息學(xué)和生物化學(xué)方法結(jié)合起來，將有可能使人們找到打開尚未開發(fā)的生物學(xué)相關(guān)代謝轉(zhuǎn)化過程的“鑰匙”。 原文鏈接： https:///10.1016/j.chom.2020.05.013
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