Cell | 鴻篇巨制，全球首次系統(tǒng)繪制小鼠腦 3D 圖譜（值得收藏）

myhalic 2020-05-14

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現(xiàn)代全腦成像技術(shù)的進步，使腦圖譜與大容量數(shù)據(jù)收集保持同步變得至關(guān)重要。近來，多科研機構(gòu)正在對小鼠腦的細胞類型和神經(jīng)連接進行研究，并跨模態(tài)、空間尺度和多腦區(qū)進行收集大量數(shù)據(jù)。然而，成功地整合上述數(shù)據(jù)需要一個標準的 3D 參考圖譜。為此，美國艾倫腦科學研究所發(fā)布了小鼠腦 3D 圖譜 - 通用坐標框架第三版（CCFv3），它可以用來分析、可視化、整合多模態(tài)和多尺度的 3D 數(shù)據(jù)集。

目前標準的 2D 小鼠腦圖譜，如艾倫參考圖譜（ARA）和小鼠腦立體定位坐標（MBSC）。其注釋是在單個平面的單一參考腦切片圖像上繪制的，染色后以細胞分辨率的光學顯微鏡成像。傳統(tǒng)的腦區(qū)分割基于細胞結(jié)構(gòu)或髓鞘結(jié)構(gòu)進行染色，腦區(qū)劃分也可以利用不同的基因表達，腦區(qū)間的連接模式與功能性質(zhì)。因為每一種模態(tài)都可能揭示某些大腦區(qū)域的獨特特征，當它們一起使用時，有望極大地改善結(jié)構(gòu)描述。然而，還沒有系統(tǒng)地整合多模態(tài)的哺乳動物腦圖譜。此外，雖然之前艾倫研究所已發(fā)布 3D 圖譜的第一和第二版，但仍然存在兩個主要問題：①在非冠狀平面將冠狀注釋的 2D 結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換成 3D 體積引起圖像失真；②目前大規(guī)模的數(shù)據(jù)生成工作需要高的細胞分辨率圖譜。本研究中發(fā)布的 CCFv3 正好解決了上述的局限。

來自美國西雅圖的艾倫腦科學研究所的 Julie A. Harris 和 Lydia Ng 團隊在 Cell 發(fā)表了題目為 The Allen Mouse Brain Common Coordinate Framework: A3D Reference Atlas 的研究論文，為我們詳細解析了 CCFv3 如何將每個半球的小鼠腦劃分成 43 個腦新皮層區(qū)，329 個皮層下灰質(zhì)結(jié)構(gòu)，81 纖維束和 8 個腦室結(jié)構(gòu)。

由于每只小鼠的大腦在體積和結(jié)構(gòu)上存在細微的差異。CCFv3 是對 1675 成年小鼠腦使用串行雙光子斷層掃描成像 (STPT) 進行構(gòu)建成的整體均值的艾倫小鼠大腦連接圖譜，其遵循了人體 MRI 為基礎(chǔ)的群體均值模板的方法。作者運用迭代過程，將每個樣本變形登記到模板中，取所有樣本的平均值，并計算出所有樣本的平均變形場，然后將其反轉(zhuǎn)并應用于創(chuàng)建的平均圖像。該算法一直持續(xù)到迭代間平均變形場的平均幅值之差降至某一閾值以下并趨于穩(wěn)定。

具體來說，圖 1A 顯示了收斂到具有明顯的解剖細節(jié)的清晰的平均圖像。為了提高計算效率，該方法首先在 50μm 分辨率下應用，直到會聚，然后在 25 μm 分辨率下進行處理，最后在 10 μm 呈現(xiàn)具有解剖結(jié)構(gòu)的 3D 圖譜模型。在 10 μm 體素分辨率下，平均模板包括 5.06 億體素（它的三維是 13.2 mm ′ 11.4 mm ′ 8 mm）。最終的平均模板包含許多可區(qū)分的、詳細的、解剖的特征，與單一樣本 STPT 的模糊結(jié)構(gòu)相比，桶狀皮層在平均模板中非常地清晰可見。這說明了，平均模板提供細胞尺度的分辨率，合適的 3D 參考大腦的分割和注釋。

平均模板腦的注釋是通過協(xié)調(diào)的、迭代的工作流來完成。①作者通過回顧以前發(fā)表的圖譜和文獻，對平均模板和五種多模態(tài)參考數(shù)據(jù)集（轉(zhuǎn)基因小鼠數(shù)據(jù)的 STPT 成像；來自艾倫連接圖譜的軸突投射數(shù)據(jù)；免疫組化和細胞結(jié)構(gòu)染色；艾倫鼠腦圖譜的原位雜交數(shù)據(jù)）進行可視化分析。②神經(jīng)解剖學家根據(jù)結(jié)構(gòu)的大小和形狀，按一定的間隔在冠狀面、矢狀面和水平面上勾畫出每個結(jié)構(gòu)。③這個編織的結(jié)構(gòu)被插圖專家填充、細化和平滑處理，然后被神經(jīng)解剖學家驗證。④一旦達到一定數(shù)量的三維重建，個體和局部結(jié)構(gòu)被合并。合并后，小的重疊和間隙被固定，因此所有的體素被分配到一個單一的大腦結(jié)構(gòu)。⑤體素標簽在一個半球完成并翻轉(zhuǎn)生成對稱的 CCFv3，最后由神經(jīng)解剖學家進行評估。

繪制整個大腦新皮層的邊界。作者利用 Calb1-Cre（Calb 在淺皮層表達）和 Fezf2-CreER（Fezf 在深部皮層表達）小鼠區(qū)分深、淺皮層；在冠狀切面上，皮層與梨狀區(qū)域的背側(cè)分界；在矢狀面上，與后下托和前方區(qū)的后方分界；在水平面上，與嗅球的后方分界。作者直接在這些 2D 視圖上繪制邊界，如下面描述集成數(shù)據(jù)，然后通過沿著流線從表面外推，將表面圖轉(zhuǎn)換為 3D 體積塊。首先將新皮層分成初級視覺區(qū)、聽覺區(qū)、軀體感覺區(qū)及后皮質(zhì)區(qū)。隨后通過轉(zhuǎn)基因鼠標記將 4 分區(qū)進行細分（如將視覺區(qū)分成 9 個小分區(qū)）。作者從頂部視角重構(gòu)了 31 個新皮層區(qū)，從側(cè)視角重構(gòu)了 33 個分區(qū)。從所有的表面觀，小鼠新皮層總共被分為 43 個亞區(qū)。此外，作者還通過組織學數(shù)據(jù)并運用 5 種轉(zhuǎn)基因鼠（均在新皮層的每一層有特異性表達的基因），將新皮層分為 L1、L2/3、L4、L5、L6a 和 L6b 層次。且這些腦新皮層的 6 層與 43 個皮層分區(qū)相交叉，形成了 242 個結(jié)構(gòu)體積塊。

緊接著，作者在又描繪出 329 個皮層下灰質(zhì)結(jié)構(gòu)，包括在 11 個主要的腦區(qū)中。作者還是從五種多模態(tài)參考數(shù)據(jù)集來描繪其邊界。以 329 個結(jié)構(gòu)中的中腦腳間核（IPN）為例，首先回顧已有的圖譜與文獻（IPN 細分成 7/8 個亞區(qū)），作者通過 Nissl 或抗體染色、轉(zhuǎn)基因表達、軸突投射 IPN 的標記及平均模板本身，將 IPN 分成 8 個亞區(qū)。作者也從冠狀面、矢狀面、水平面描繪出各亞區(qū)的大小、形狀及位置。平均模板體積中的大多數(shù)體素是在對 329 個皮層下灰質(zhì)結(jié)構(gòu)進行細分后標記的，在腦灰質(zhì)中還有一些間隙 (不標記體素)。

之后，作者又通過順行示蹤和抗體染色描繪了腦白質(zhì)纖維束，通過比較平均模板和相應的順行追蹤（直接標記組成這些束的軸突）數(shù)據(jù)，可以很容易地定義這些白質(zhì)束的輪廓和軌跡。作者三維重建了小鼠腦中的 81 個纖維束，明確了其位置、形狀、大小和軌跡。同時作者主要基于平均模板的固有對比，結(jié)合相應的 Nissl 染色，勾畫出腦室的 3D 結(jié)構(gòu)，作者重構(gòu)建了 8 個腦室及相關(guān)結(jié)構(gòu)。

最后，與其余圖譜相比，作者列舉了一些 CCFv3 獨特的結(jié)構(gòu)：IPN 的亞區(qū) IPRL 是首次被描繪；外側(cè)膝狀體（LGd）的背側(cè)被進一步細分成 LGd-sh，LG-co，LG-ip 三個亞區(qū)；增加了視覺和聽覺輻射、胼胝體的主體（ccb）、胼胝體上腦白質(zhì)（scwm）等 4 個纖維束。

CCFv3 具有哪些優(yōu)點呢？①圖譜的圖像查看器提供了在單個窗口中查看和導航多個數(shù)據(jù)集的能力，比較來自多個實驗的不同表達或連接模式。②支持在 CCFv3 本體樹中對感興趣的結(jié)構(gòu)進行鏈接瀏覽和可視化，或加載不同結(jié)構(gòu)集的 3D 模型。③CCFv3 采集了高信噪比全腦高分辨率圖像（CCFv3 空間分辨率是第二版圖譜的 1000 多倍），更容易分辨解剖學細節(jié)的。④CCFv3 新增兩個功能：原始圖譜中查看注釋（reverse mapping）和體積估計。⑤CCFv3 有空間坐標系統(tǒng)及有序的結(jié)構(gòu)本體，可以以多分辨率的交互式訪問圖譜。當然也可以選擇二維或三維方式來瀏覽。⑥CCFv3 還為分布于全腦的大規(guī)模電生理學實驗及腦皮層寬視野鈣成像提供解剖學背景。