今天為大家介紹一篇單細(xì)胞分析乳腺癌中癌癥干細(xì)胞的文章[Identification of Distinct Breast Cancer Stem Cell Populations Based on Single-Cell Analyses of Functionally Enriched Stem and Progenitor Pools (Stem Cell Reports; 2016;IF:6+)],這篇文章對(duì)乳腺癌干性細(xì)胞進(jìn)行了詳細(xì)分析與刻畫(huà)，特別是對(duì)單細(xì)胞感興趣的小伙伴可以好好研究下。

 由于疾病的復(fù)雜性和一般標(biāo)記物的缺乏，鑒定具有真正惡性干細(xì)胞特性的乳腺癌細(xì)胞亞群成為了一項(xiàng)挑戰(zhàn)。作者使用三種功能富集策略，識(shí)別出了乳腺癌中不同的干性細(xì)胞簇，其中雌激素受體（ER）a +腫瘤具有清晰的組織分層，不同簇之間具有開(kāi)關(guān)樣和逐漸過(guò)渡，說(shuō)明乳腺癌細(xì)胞以連續(xù)方式在離散的分化狀態(tài)之間轉(zhuǎn)移。 ERa-乳腺癌顯示不太明顯的聚集，但與ERa +癌癥共享一個(gè)靜息癌癥干細(xì)胞池。 細(xì)胞組織模型由來(lái)自原發(fā)性腫瘤的單細(xì)胞數(shù)據(jù)支持。 這些發(fā)現(xiàn)有利于我們了解單細(xì)胞水平的乳腺癌組織，從而可以更好地識(shí)別和靶向癌癥干細(xì)胞。說(shuō)到這里我們首先介紹下這三種干細(xì)胞的富集的方法：

如上圖所示，第一種干細(xì)胞富集方法是抗失巢凋亡的細(xì)胞AR，即不依賴貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞；第二種是在缺氧條件下培養(yǎng)的細(xì)胞；第三種是親脂性PKH26染料標(biāo)簽維持的細(xì)胞。

而單細(xì)胞表達(dá)數(shù)據(jù)的獲取過(guò)程如下：

獲取了單細(xì)胞的表達(dá)數(shù)據(jù)后作者進(jìn)一步通過(guò)文獻(xiàn)搜集到了不同功能狀態(tài)的marker基因，與分化相關(guān)的關(guān)鍵markers（CDH1，CD24，EPCAM，ESR1，PGR），乳腺癌干性相關(guān)的markers（CD44，ITGA6，DNER，ALDH1A3，ABCG2），多能性相關(guān)的markers（POU5F1，NANOG，SOX2），EMT /轉(zhuǎn)移markers（SNAI1，SNAI2，F(xiàn)OSL1，VIM，CDH2，ID1）和增殖相關(guān)的markers（CCNA2，MKI67，ERBB2）具體如下：

主要的方法概念介紹好了，接下來(lái)我們看下作者得到哪些主要的結(jié)果吧：

結(jié)果1：在ERa+細(xì)胞系中定義具有CSC和不同分化表型的亞群

圖A作者對(duì)MCF7細(xì)胞系中抗失巢凋亡的細(xì)胞與貼壁生長(zhǎng)的單層細(xì)胞的表達(dá)情況做了PCA分析，然后作者又在圖B進(jìn)一步分析了基因在PCA中的載荷,從圖A中可以看出細(xì)胞系被分成了三類分別是ERa+ I,ERa+ II,ERa+ III,圖C中可以看出不同功能狀態(tài)的marker在三類細(xì)胞中的表達(dá)情況。根據(jù)三類細(xì)胞marker基因的表達(dá)高低可以看出ERa + I細(xì)胞顯示多能性相關(guān)基因NANOG和POU5F1的高表達(dá)，分化和增殖相關(guān)基因低表達(dá)，以及總轉(zhuǎn)錄水平較低，表明這些細(xì)胞可能處于靜止?fàn)顟B(tài)，ERa + II細(xì)胞表現(xiàn)出乳腺CSC相關(guān)基因（CD44，ALDH1A3和ABCG2）和增殖相關(guān)基因（CCNA2，MKI67和ERBB2）的高表達(dá)，通過(guò)分化相關(guān)基因和增殖標(biāo)志物的高表達(dá)來(lái)刻畫(huà)ERa+ III細(xì)胞。接著作者又對(duì)ML和AR兩類細(xì)胞進(jìn)行了差異表達(dá)。

為了對(duì)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證，作者同樣對(duì)T47D細(xì)胞系的不同細(xì)胞的表達(dá)情況進(jìn)行了同樣的分析，可以看出經(jīng)過(guò)PCA細(xì)胞被分成了兩類，并分析不同marker的表達(dá)。為了鑒定所應(yīng)用的CSC富集方法中涉及的基因和過(guò)程，比較了ML和AR細(xì)胞之間差異表達(dá)的基因。 在AR細(xì)胞中，CDH1，CD24，EPCAM，ESR1，PGR和ID1被下調(diào)并且FOSL1在兩種細(xì)胞類型中上調(diào)，而CCNA2僅在MCF7細(xì)胞中下調(diào)（圖2D和2H）。 MCF7和T47D細(xì)胞的這種共同調(diào)節(jié)表明類似的富集機(jī)制。

結(jié)果2：定義ERa-乳腺癌細(xì)胞系的增殖表型

作者對(duì)兩類ERa-細(xì)胞系即CAL120與MDA231這兩類細(xì)胞系的ML與AR細(xì)胞打的表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行了與結(jié)果1同樣的操作，PCA分析以及marker表達(dá)的分析，分析細(xì)胞傾向于哪種功能狀態(tài)。將CAL120細(xì)胞分成了ERa-I，ERa-III。同樣地，159個(gè)單獨(dú)的MDA231細(xì)胞（ML：n = 84; AR：n = 75）的PCA顯示存在兩個(gè)細(xì)胞簇ERα-II和III。 ALAH1A3，ABCG2和SNAI1在ERα-II細(xì)胞中略微但不顯著地上調(diào)。 ERa -III細(xì)胞表現(xiàn)出FOSL1，VIM，CCNA2和MKI67的升高的表達(dá)。 AR細(xì)胞富集在簇ERα-II中，而ML細(xì)胞富集在簇ERα-III中。

結(jié)果3：在ERα+和ERα-細(xì)胞中識(shí)別共同的CSC亞群

為了檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞中的共同亞群，將所有單細(xì)胞數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化，合并，并進(jìn)行組合分析，上圖示意性地說(shuō)明了所識(shí)別的子群體之間的分層組織。 在ERα+細(xì)胞系中鑒定出兩種不同的分化模式。 MCF7細(xì)胞在它們獲得完全分化的表型（ERα+ III）之前通過(guò)祖細(xì)胞樣狀態(tài)ERα+ II分化，而T47D細(xì)胞在不通過(guò)這種祖細(xì)胞狀態(tài)的情況下分化。 另一方面，ERα-細(xì)胞系似乎通過(guò)增加與ERα+細(xì)胞共享的常見(jiàn)靜止CSC樣池的增殖能力來(lái)區(qū)分。

為了驗(yàn)證我們?cè)谂R床背景下的發(fā)現(xiàn)，我們接下來(lái)分析了兩個(gè)原發(fā)性乳腺癌樣本中的單個(gè)細(xì)胞，而其他細(xì)胞表達(dá)與分化的細(xì)胞狀態(tài)相關(guān)的標(biāo)志物。具有共同的未分化基因表達(dá)譜的細(xì)胞數(shù)量相當(dāng)高，可能包括常見(jiàn)的祖細(xì)胞和CSC。圖G總結(jié)了原發(fā)性腫瘤細(xì)胞中的分化途徑，其與基于CSC部分的操作描繪的細(xì)胞系劃分的細(xì)胞層次一致。

結(jié)果4：缺氧條件下在ERα+ MCF7細(xì)胞中富集具有CSC特征的兩個(gè)不同群體

結(jié)果4的分析方法基本與之前相同，在缺氧條件下，對(duì)ERa+細(xì)胞系的表達(dá)情況進(jìn)行分析，用CA9來(lái)判斷缺氧情況，由于PCA分類的結(jié)果不理想，所以采用自組織映射的方法將細(xì)胞分成四類，這四類細(xì)胞的表達(dá)情況如圖D所示，并對(duì)缺氧和正常細(xì)胞的表達(dá)進(jìn)行了差異表達(dá)分析。

結(jié)果5：刻畫(huà)了標(biāo)記保留的MCF7細(xì)胞中三個(gè)CSC樣表型的亞群

在結(jié)果5中，作者分析了染色標(biāo)簽保留的細(xì)胞的表達(dá)譜，用自組織映射分析，將細(xì)胞劃分成三類，這三類細(xì)胞不同功能狀態(tài)marker的表達(dá)熱圖如上圖所示，可以看出三類細(xì)胞的表達(dá)有差異，具有不同的表達(dá)表型。

結(jié)果6：ERa + MCF7細(xì)胞包含不同的細(xì)胞狀態(tài)，并有不同的組織分層

來(lái)自三種CSC富集技術(shù)（包括相應(yīng)的單層群體）的所有MCF7單細(xì)胞數(shù)據(jù)組合，PCA和SOM允許我們關(guān)聯(lián)和分層組織鑒定表型狀態(tài)。 可以使用SOM將單個(gè)細(xì)胞分成四個(gè)穩(wěn)定簇（MCF7 I-IV）。來(lái)自三種富集技術(shù)的細(xì)胞存在于所有定義的簇中比例不同，MCF I對(duì)應(yīng)于ERα+ I，MCF II-III對(duì)應(yīng)于ERα+ II，MCF III對(duì)應(yīng)于ERα+ III。 基于所鑒定的簇之間觀察到的逐漸基因調(diào)節(jié)，提出了MCF7細(xì)胞的分層組織(圖D).在這種情況下，具有靜止CSC特征的MCF7 I組代表層次結(jié)構(gòu)的頂點(diǎn)，并且在不同的細(xì)胞狀態(tài)上發(fā)生分化，發(fā)生在MCF7 IV組中最分化的細(xì)胞。 首先，上皮基因在與EMT相關(guān)的基因同時(shí)被激活，并且乳腺CSC變得失活。 然后，在第二步中，與多能性相關(guān)基因下調(diào)同時(shí)上調(diào)與增殖相關(guān)的基因。

到這里，主要的結(jié)果和方法就介紹完了，是不是也有很多收獲呢，這篇文章通過(guò)單細(xì)胞對(duì)乳腺癌中的干性細(xì)胞進(jìn)行詳細(xì)的刻畫(huà)，尤其單細(xì)胞層面可以更好的刻畫(huà)腫瘤異質(zhì)性，值得我們學(xué)習(xí)。