1.14

NK細(xì)胞刺激cDC1募集到腫瘤微環(huán)境中促進(jìn)癌癥免疫調(diào)節(jié)

NK Cells Stimulate Recruitment of cDC1 into the Tumor Microenvironment Promoting Cancer Immune Control

Cell (IF= 31.398)

01

背景介紹

1.腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment）：一個(gè)成型的腫瘤是一個(gè)復(fù)雜的組織，它不僅由腫瘤細(xì)胞組成，還包括也基質(zhì)細(xì)胞，炎癥細(xì)胞，脈管系統(tǒng)和細(xì)胞外基質(zhì)（ECM），所有這些總和定義為腫瘤微環(huán)境。

2.為什么要研究樹(shù)突狀細(xì)胞？

T和B淋巴細(xì)胞是適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的基本效應(yīng)細(xì)胞，但APC（抗原遞呈細(xì)胞）作為其上游，起著守門員的角色，幾乎可以啟動(dòng)和塑造任何適應(yīng)性免疫反應(yīng)。樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）就是APC中遞呈抗原能力ZUI強(qiáng)的一種。

越來(lái)越多的證據(jù)表明，DC對(duì)于致耐受性或促炎性局部免疫環(huán)境是至關(guān)重要的，因此，在自身免疫性疾病以及癌癥等疾病中，將DC的生物學(xué)機(jī)制研究清楚，就可能揭示治療干預(yù)的新方法。

3.分析步驟詳解

第一步，首先是常規(guī)的圈取液流穩(wěn)定部分、選擇單個(gè)核細(xì)胞區(qū)域、排除粘連體、圈選CD45+活細(xì)胞區(qū)域。

第二步，通過(guò)CD16/CD14，圈出CD14+單核細(xì)胞和CD14-細(xì)胞，接著將CD14-細(xì)胞顯示在CD19/CD3圖上，圈出CD3+T細(xì)胞、CD19+B細(xì)胞、CD3-CD19-細(xì)胞，在這里CD3+T可通過(guò)CD4/CD8分為CD4+T、CD8+T、DNT三個(gè)主要亞群;

對(duì)CD4+T和CD8+T兩個(gè)亞群，可進(jìn)一步通過(guò)CCR7和CD45RA圈出其中Naive功能狀態(tài)的亞群；而CD19+B細(xì)胞則可繼續(xù)分析其CD80+的比例。

第三步，對(duì)第二步中圈出的CD14-CD3-CD19-部分細(xì)胞，進(jìn)一步用CD56/CD123散點(diǎn)圖分析，圈出CD56+NK、CD123高表達(dá)的pDC、CD56-CD123low的DC候選群體，接著可根據(jù)CD11c/HLA-DR，圈出準(zhǔn)確的雙陽(yáng)性DC群體，最后根據(jù)CD141/CD1c分析DC（不包括pDC）中的三個(gè)亞群：CD141+DC、CD1c+DC、DN DC。

第四步，分析pDC、CD141+DC、CD1c+DC、DN DC四個(gè)亞群中CD26、BTLA、CD32、CD38、CX3CR1、CD85k、CD11b、sirpa、CD40、CD86、CD45RA的表達(dá)水平。

最后一步，利用FMO作為設(shè)門對(duì)照，分析總DC中CX3CR1、CD85k、CD40、CD163、CD86的表達(dá)水平。

以下是該方案分析的亞群：

B細(xì)胞（CD45.2＋CD19＋），T細(xì)胞（CD45.2＋TCRβ＋），NK細(xì)胞（CD45.2＋TCRβ－CD49b＋NKp46＋），髓系細(xì)胞（CD45.2＋CD11b＋）。

髓系細(xì)胞進(jìn)一步分為：

樹(shù)突狀細(xì)胞（CD45.2＋CD11b＋CD11c＋MHCII＋，包括淋巴樣DC和髓樣DC）；

中性粒細(xì)胞（CD45.2＋CD11b＋Ly6G＋）；

巨噬細(xì)胞（CD45.2＋CD11b＋Ly6G－Ly6C low，包括AAM）；

單核細(xì)胞（CD45.2＋CD11b＋Ly6G－Ly6C high）；

4.常規(guī)DC（cDC）對(duì)抗腫瘤免疫的貢獻(xiàn)主要體現(xiàn)在它們呈現(xiàn)腫瘤抗原和分泌調(diào)節(jié)T細(xì)胞存活和效應(yīng)子功能的細(xì)胞因子的能力。

cDC可以分為至少兩個(gè)子集，常規(guī)1型樹(shù)突狀細(xì)胞（cDC1）和常規(guī)2型樹(shù)突狀細(xì)胞（cDC2）。cDC1子集依賴于其轉(zhuǎn)錄因子Batf3的發(fā)育，并且可以通過(guò)選擇性表達(dá)C型凝集素受體DNGR-1（又名CLEC9A）和趨化因子受體XCR1來(lái)鑒定，以及在非淋巴器官和腫瘤中在CD11b低表達(dá)的情況下整合素aE（CD103）的高表達(dá)。cDC1子集依賴于其轉(zhuǎn)錄因子Batf3的發(fā)育，并且可以通過(guò)在非淋巴器官和腫瘤中選擇性表達(dá)C型凝集素受體DNGR-1（又名CLEC9A）和趨化因子受體XCR1來(lái)鑒定。在Batf3- /-小鼠中cDC1的缺乏消除了免疫原性腫瘤的排斥以及對(duì)過(guò)繼性T細(xì)胞療法和免疫檢查點(diǎn)封鎖的反應(yīng)。

5.前列腺素E2（PGE2）是一種具有免疫調(diào)節(jié)功能的前列腺素，由多種細(xì)胞類型產(chǎn)生，并在細(xì)胞死亡后進(jìn)一步釋放。先前發(fā)現(xiàn)許多腫瘤分泌PGE2來(lái)抑制抗癌免疫力。在此類腫瘤中，由Ptgs1和Ptgs2基因編碼的環(huán)氧合酶的遺傳消融導(dǎo)致無(wú)法產(chǎn)生PGE2，并使癌癥易感于依賴cDC1的CD8 + T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫控制。因此，缺乏PGE2產(chǎn)生的小鼠腫瘤是一個(gè)理想的系統(tǒng)，可以剖析cDC1積累的潛在機(jī)制。

02

全文思路

03

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Fig1.cDC1在COX缺乏型腫瘤的腫瘤微環(huán)境中累積；

圖1A：

圖文描述：將2 x106個(gè)Ptgs1 / Ptgs2 -/- BRAFV600E細(xì)胞皮下注射至野生型（WT）小鼠體內(nèi)。4天后通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析了腫瘤浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞。

結(jié)果分析：作者建立了流式細(xì)胞術(shù)染色方案，可以區(qū)分腫瘤中的cDC1和其他CD11c + II類MHC（MHCII）+骨髓細(xì)胞群，包括CD64 +巨噬細(xì)胞和CD11b + cDC2。

補(bǔ)充知識(shí)點(diǎn)：CD11c 是DC成熟的標(biāo)志，MHCⅠ與MHCⅡ是DC表面呈遞抗原的重要分子，MHCⅠ分子主要呈遞細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的抗原，MHCⅡ分子主要呈遞細(xì)胞外產(chǎn)生的抗原。CD40、CD80和CD86是DC表面的共刺激分子。

圖1B：

圖文描述：腫瘤內(nèi)cDC1和CD103- CD11c + MHCII +細(xì)胞的cDC1標(biāo)記分析。

樹(shù)突狀細(xì)胞自然殺傷細(xì)胞凝集素家族受體1(DC NK lectin group receptor-1,DNGR-1)；

趨化因子C-基元受體1(XCR1)重組蛋白；

干擾素調(diào)節(jié)因子8(Interferon regμlatory factor8, IRF8),又名干擾素同源序列結(jié)合蛋白。

圖1C：

圖文描述：將2 x106個(gè)對(duì)照細(xì)胞或Ptgs1 / Ptgs2 -/- BRAFV600E黑色素瘤細(xì)胞皮下接種至WT小鼠后4天，量化腫瘤塊大小和腫瘤內(nèi)免疫細(xì)胞。

結(jié)果分析：對(duì)照組和Ptgs1 / Ptgs2- /-BRAF-V600E腫瘤在CD45 +白細(xì)胞總數(shù)，CD11c + MHCII +細(xì)胞總數(shù)和腫瘤腫塊方面大致相同。然而，Ptgs 1/Ptgs 2- /-BRAFV600E顯示cDC1在比例和總數(shù)上明顯增加。

圖1D：

圖文描述：對(duì)照組和Ptgs1 / Ptgs2 -/- BRAFV600E腫瘤的代表性切片。箭頭指示cDC1的多細(xì)胞簇。比例尺，50毫米。

結(jié)果分析：與流式細(xì)胞分析相一致的是，cDC1在對(duì)照組中的免疫熒光共焦圖像中稀疏，而在ptgs 1/ptgs 2-/-BRAFV600E腫瘤中則非常豐富。

圖1E，F(xiàn)：

圖文描述：E是D圖像的表面重建，顯示了對(duì)照組和Ptgs1 / Ptgs2 -/- BRAFV600E黑色素瘤中cDC1和CD103 MHCII +細(xì)胞的定位。F是基于E的距離分析。數(shù)據(jù)代表來(lái)自6個(gè)腫瘤的8張圖像的量化。

結(jié)果分析：共聚焦圖像中cDC1輪廓的表面重建后，通過(guò)距離分析確認(rèn)了cDC1s的腫瘤浸潤(rùn)，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照腫瘤相比，Ptgs1 / Ptgs2 -/- BRAFV600E黑色素瘤中的cDC1距腫瘤邊緣和CD31 +血管更遠(yuǎn)。

圖1G，H：

圖文描述：用2x105個(gè)對(duì)照細(xì)胞或Ptgs1 / Ptgs2 -/- BRAFV600E細(xì)胞接種WT或Batf3- /-小鼠，并隨時(shí)間分析腫瘤生長(zhǎng)。12天后，對(duì)T細(xì)胞進(jìn)行定量（H）。

結(jié)果分析：COX缺乏對(duì)腫瘤有免疫控制的作用，在缺乏cDC1的Batf3-/-小鼠中失去了這種控制作用。這種失控與CD8 + T細(xì)胞的腫瘤浸潤(rùn)明顯減少有關(guān)，與CD4+T細(xì)胞無(wú)關(guān)。

圖1I：

圖文描述：WT和Batf3- /-小鼠被帶有2x106個(gè)對(duì)照或Ptgs1 / Ptgs2 / BRAFV600E細(xì)胞皮下注射。12天后對(duì)細(xì)胞內(nèi)GzmB（顆粒酶B）進(jìn)行染色。

結(jié)果分析：與野生型相比，Batf3- /-小鼠中的CD8+記憶T細(xì)胞（TRM）和CD8+CD103-的T細(xì)胞的顆粒酶B表達(dá)都降低，但在CD4+的T細(xì)胞中并無(wú)此發(fā)現(xiàn)。

Fig2.在COX缺乏的BRAFV600E黑色素瘤中cDC1的積累取決于NK細(xì)胞；

圖2A：

圖文描述：對(duì)對(duì)照或Ptgs1 / Ptgs2- /- BRAFV600E腫瘤中的腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的定量（第4天）。

結(jié)果分析：除了cDC1的增加和T細(xì)胞群體峰值增加外，Ptgs1 / Ptgs2- /- BRAFV600E黑色素瘤還顯示NK細(xì)胞和CD3+細(xì)胞的顯著升高。

圖2B：

圖文描述：Ptgs1 / Ptgs2 -/- BRAFV600E腫瘤的圖像。對(duì)照組中此細(xì)胞表達(dá)很低。插圖顯示多細(xì)胞簇CD103 + cDC1和NK1.1 +細(xì)胞的共定位。比例尺，50毫米。虛線表示腫瘤邊緣。

結(jié)果分析：腫瘤內(nèi)NK細(xì)胞的分布與cDC1高度相似，這表現(xiàn)為兩種細(xì)胞類型的多細(xì)胞簇位于彼此的5-10 mm之內(nèi)。

圖2C：

圖文描述：基于（B）的距離分析。數(shù)據(jù)代表來(lái)自6個(gè)腫瘤的6張圖像的量化。

結(jié)果分析：結(jié)果顯示cDC1相對(duì)于其他MHCII細(xì)胞更接近NK細(xì)胞。

圖2D：

圖文描述：來(lái)自MMTV-PyMT小鼠的腫瘤圖像。插圖顯示CD103 + cDC1和NK1.1 +細(xì)胞的共定位。比例尺，100毫米。

結(jié)果分析：同樣，在自發(fā)的基因工程乳腺癌模型（MMTV-PyMT）中，在多細(xì)胞簇中發(fā)現(xiàn)cDC1和NK細(xì)胞，這表明共定位不是腫瘤細(xì)胞移植的結(jié)果。

圖2E：

圖文描述：基于（D）的距離分析。數(shù)據(jù)代表來(lái)自4個(gè)腫瘤的8張圖像的量化。

結(jié)果分析：在自發(fā)的基因工程乳腺癌模型（MMTV-PyMT）中，cDC1相對(duì)于其他MHCII細(xì)胞更接近NK細(xì)胞。

圖2F：

圖文描述：在皮下注射后4天，對(duì)對(duì)照和Ptgs1 / Ptgs2 -/- BRAFV600E腫瘤中cDC1的定量。將2x106個(gè)腫瘤細(xì)胞接種到WT小鼠，Rag1 -/-小鼠或Rag2 -/ -Il2rg -/-小鼠中。

補(bǔ)充知識(shí)：Rag1 -/-小鼠缺乏T細(xì)胞，B細(xì)胞，但有NK細(xì)胞；Rag2 -/ -Il2rg -/-小鼠缺乏T細(xì)胞，B細(xì)胞，NK細(xì)胞。

結(jié)果分析：在野生型（WT）和Rag1 -/-小鼠中觀察到許多cDC1，但在移植到Rag2 -/- Il2rg- /-小鼠的腫瘤中cDC1未能積聚。說(shuō)明T細(xì)胞和B細(xì)胞不影響cDC1的募集，而NK細(xì)胞會(huì)影響。F和G都說(shuō)明了cDC1的募集是依賴于NK細(xì)胞的。

圖2H：

圖文描述：在接種WT小鼠或Batf3 -/-小鼠后4天，對(duì)對(duì)照或Ptgs1 / Ptgs2 -/ -BRAFV600E腫瘤中的NK細(xì)胞進(jìn)行定量。

結(jié)果分析：與觀察到的cDC1積累對(duì)腫瘤內(nèi)NK細(xì)胞的依賴性相反，Batf3-/-小鼠的cDC1缺乏對(duì)Ptgs1 / Ptgs2 -/- BRAFV600E腫瘤中的NK細(xì)胞數(shù)量沒(méi)有影響。所以cDC1并不影響NK細(xì)胞的富集。

圖2I：

圖文描述：NK細(xì)胞耗竭對(duì)WT和Batf3- /-小鼠中Ptgs1 / Ptgs2 -/- BRAFV600E腫瘤生長(zhǎng)的影響。

結(jié)果分析：抗體介導(dǎo)的NK細(xì)胞耗竭導(dǎo)致WT小鼠Ptgs1 / Ptgs2 -/- BRAFV600E腫瘤的快速生長(zhǎng)。但是在Batf3- /-小鼠中無(wú)此現(xiàn)象。說(shuō)明NK細(xì)胞是通過(guò)cDC1來(lái)抑制腫瘤生長(zhǎng)的。cDC1可以影響NK細(xì)胞的功能。

Fig3.NK細(xì)胞是腫瘤中XCL1和CCL5的主要來(lái)源，并直接被PGE2抑制；

圖3A：

圖文描述：基于對(duì)來(lái)自脾臟免疫細(xì)胞的整體基因表達(dá)數(shù)據(jù)的分析，小鼠NK細(xì)胞對(duì)趨化因子的選擇性表達(dá)（數(shù)據(jù)集GSE15907）。

結(jié)果分析：免疫基因組（ImmGen）項(xiàng)目的基因表達(dá)數(shù)據(jù)分析表明，NK細(xì)胞可以表達(dá)6種趨化因子CCL5，CCL3，XCL1，CXCL1，CCL4和CCL27A（可以借鑒）。

圖3B：

圖文描述：WT小鼠經(jīng)皮下注射，用2x106個(gè)對(duì)照或Ptgs1 / Ptgs2- /- BRAFV600E細(xì)胞，并在4天后取出腫瘤。通過(guò)蛋白質(zhì)陣列確定的腫瘤裂解物中的趨化因子表達(dá)。

結(jié)果分析：在蛋白質(zhì)陣列中，Ptgs1 / Ptgs2 -/- BRAFV600E早期（第4天）腫瘤的裂解物顯示的CCL5和CXCL10比COX充足的對(duì)照腫瘤裂解物高。

圖3C：

圖文描述：基于（B）的光密度分析的相對(duì)趨化因子表達(dá)（定量分析）。

結(jié)果分析：在蛋白質(zhì)陣列中，Ptgs1 / Ptgs2 -/- BRAFV600E早期（第4天）腫瘤的裂解物顯示的CCL5比COX充足的對(duì)照腫瘤裂解物高45倍，而CCL27A的裂解率則略有增加（<2倍）。NK細(xì)胞產(chǎn)生的其他趨化因子要么在對(duì)照組與Ptgs 1/Ptgs 2之間略有下降(CXCL 1)。或者蛋白陣列中的BRAFV600E腫瘤無(wú)法檢測(cè)到裂解(CCL 3和CCl 4)。

圖3D：

圖文描述：植瘤4天后，測(cè)量總腫瘤提取物中的CCL5蛋白水平。

結(jié)果分析：Ptgs1 / Ptgs2 -/- BRAFV600E腫瘤的裂解物中高水平的CCL5蛋白，但對(duì)照BRAFV600E腫瘤裂解物中卻沒(méi)有，這個(gè)結(jié)果通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)珠陣列（CBA）分析得到證實(shí)。

圖3E：

圖文描述：植瘤4天后，測(cè)量總腫瘤提取物中Xcl1 mRNA水平。

結(jié)果分析：因?yàn)閄cl1，即cDC1表達(dá)的趨化因子受體XCR1的配體，在蛋白質(zhì)或細(xì)胞計(jì)數(shù)微珠陣列中不存在，所以分析了腫瘤提取物中的Xcl1 mRNA。與CCL5蛋白類似，Ptgs1 / Ptgs2 -/- BRAFV600E第4天腫瘤中含有大量XCL1轉(zhuǎn)錄本，而對(duì)照組沒(méi)有。

圖3F：

圖文描述：植瘤4天后，免疫細(xì)胞內(nèi)CCL5蛋白的流式細(xì)胞儀分析。

結(jié)果分析：通過(guò)細(xì)胞內(nèi)流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)，Ptgs1 / Ptgs2 -/ -BRAFV600E腫瘤中NK細(xì)胞而非MHCII +細(xì)胞的CCL5蛋白染色呈陽(yáng)性，而非對(duì)照組腫瘤。在此時(shí)間點(diǎn)，罕見(jiàn)的浸潤(rùn)性CD8 + T細(xì)胞也產(chǎn)生了CCL5。

圖3G：

圖文描述：植瘤4天后，免疫細(xì)胞內(nèi)Xcl1 mRNA的流式細(xì)胞儀分析。

結(jié)果分析：通過(guò)細(xì)胞內(nèi)流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，Ptgs1 / Ptgs2 -/ -BRAFV600E腫瘤中NK細(xì)胞而非MHCII +細(xì)胞的Xcl1 mRNA表達(dá)增加。在此時(shí)間點(diǎn)，罕見(jiàn)的浸潤(rùn)性CD8 + T細(xì)胞僅表達(dá)低水平的Xcl1 mRNA，且對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組無(wú)差異。

圖3H，I：

圖文描述：在植入后12天，對(duì)照組和Ptgs1 / Ptgs2 -/- BRAFV600E腫瘤的NK細(xì)胞和T細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)CCL5蛋白。

結(jié)果分析：在Ptgs1 / Ptgs2- / -BRAFV600E腫瘤的NK和CD8 + T細(xì)胞中可檢測(cè)到CCL5蛋白表達(dá)上升。

圖3J：

圖文描述：在植入后12天對(duì)腫瘤進(jìn)行了分析，對(duì)細(xì)胞內(nèi)Xcl1 mRNA表達(dá)進(jìn)行定量。

結(jié)果分析：Xcl1 mRNA仍然很大程度上局限于NK細(xì)胞，并且沒(méi)有任何T細(xì)胞（包括TRM）高表達(dá)。

圖3K，L，M：

圖文描述：分析來(lái)自MMTV-PyMT雌性小鼠乳腺腫瘤中免疫細(xì)胞產(chǎn)生的CCL5和Xcl1。顯示細(xì)胞內(nèi)CCL5蛋白和Xcl1 mRNA水平的代表性圖。

結(jié)果分析：在mmtv-pymt小鼠自發(fā)發(fā)展的乳腺腫瘤中也有類似的觀察。

圖4A，B：

圖文描述：WT小鼠，消耗掉NK細(xì)胞的WT小鼠，Rag1 -/-小鼠被皮下注射。用2x106個(gè)對(duì)照或Ptgs1 / Ptgs2 / BRAFV600E細(xì)胞，并在4天后分析CCL5蛋白和Xcl1 mRNA。

結(jié)果分析：WT和Rag1 -/-小鼠第4天Ptgs1 / Ptgs2 -/- BRAFV600E腫瘤中CCL5蛋白水平相同，但在NK細(xì)胞耗竭的WT小鼠中CCL5蛋白水平和Xcl1 mRNA嚴(yán)重降低。

圖4C，D：

圖文描述：WT小鼠，Rag1 -/-和Rag2 -/- Il2rg -/-小鼠被皮下注射。用2x106個(gè)對(duì)照或Ptgs1 / Ptgs2- / -BRAFV600E細(xì)胞，并在4天后分析CCL5蛋白和Xcl1 mRNA。

結(jié)果分析：同樣，在移植到Rag2- /- Il2rg- /-小鼠的Ptgs1 / Ptgs2 -/- BRAFV600E腫瘤中檢測(cè)到非常低的CCL5蛋白和Xcl1 mRNA水平。直接反應(yīng)了NK細(xì)胞是CCL5以及Xcl1的來(lái)源。

圖4E，F(xiàn)：

圖文描述：將WT小鼠的脾臟NK細(xì)胞與IL-2一起培養(yǎng)，并在有或沒(méi)有所示濃度的PGE2的情況下，用NK1.1激活劑刺激16小時(shí)。分析培養(yǎng)上清液中的CCL5蛋白和XCL1蛋白。

結(jié)果分析：NK1.1激活可誘導(dǎo)CCL5和XCL1分泌，并且PGE2以劑量依賴性方式大大降低了CCL5和XCL1分泌。

圖4G：

圖文描述：將WT小鼠的脾臟NK細(xì)胞與IL-2一起培養(yǎng)，并在存在或不存在所示濃度的PGE2的情況下，用NK1.1激活刺激16小時(shí)。使用碘化丙啶通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析來(lái)分析NK細(xì)胞的存活。白色代表活細(xì)胞，黑色代表死細(xì)胞

結(jié)果分析：即使在白細(xì)胞介素2存在的情況下，PGE 2也顯著降低了NK細(xì)胞的存活。

圖4H，I：

圖文描述：在存在或不存在所示濃度的PGE 2的情況下，用NK1.1激活刺激從Ptgs1 / Ptgs2- /- BRAFV600E腫瘤分離的NK細(xì)胞刺激16小時(shí)。分析培養(yǎng)上清液中的CCL5和XCL1蛋白。

結(jié)果分析：CCL5和XCL1水平說(shuō)明與脾NK細(xì)胞相似，從腫瘤中分離出的NK細(xì)胞也容易受到PGE 2的抑制。

圖4J：

圖文描述：在腫瘤移植后第4天和第12天，BRAFV600E腫瘤中NK細(xì)胞上TIM-3和PD-1的表達(dá)。

結(jié)果分析：盡管PGE2對(duì)功能和存活有顯著影響，但在體外或體內(nèi)，NK細(xì)胞不會(huì)誘導(dǎo)共抑制受體TIM-3和PD-1的表達(dá)。

Fig4，XCL1和CCL5將cDC1的募集到腫瘤中以促進(jìn)免疫控制；

圖5A：

圖文描述：cDC1向CCL5或XCL1的遷移。

結(jié)果分析：cDC1表達(dá)XCR1（XCL1的唯一受體）以及CCR1和CCR5，兩者均結(jié)合CCL5。與這種表達(dá)模式相一致的是，體外培養(yǎng)的骨髓細(xì)胞產(chǎn)生的cDC1在Transwell檢測(cè)中向ccl 5和xcl 1遷移。

圖5B：

圖文描述：cDC1在注射了抗CCL5和抗XCL1抗體或相應(yīng)同種型匹配的對(duì)照的WT小鼠的Ptgs1 / Ptgs2 / BRAFV600E腫瘤中的蓄積。

結(jié)果分析：在體內(nèi)阻斷CCL5和XCL1導(dǎo)致腫瘤中CDC1的蓄積顯著減少。

圖5C，D，E：

圖文描述：皮下注射后4天腫瘤內(nèi)cDC1的定量，注射2 x106個(gè)過(guò)表達(dá)CCL5或XCL1或用空載體（EMPTY）轉(zhuǎn)導(dǎo)的Ptgs1 / Ptgs2 -/- BRAFV600E細(xì)胞。將2x105個(gè)細(xì)胞移植到WT小鼠或Batf3- /-小鼠中。

結(jié)果分析：接種WT小鼠后四天，與EMPTY細(xì)胞形成的腫瘤相比，過(guò)表達(dá)CCL5或XCL1的Ptgs1 / Ptgs2 / BRAFV600E腫瘤中cDC1的積累顯著增加。與EMPTY細(xì)胞相比，過(guò)表達(dá)CCL5或XCL1的Ptgs1 / Ptgs2 -/- BRAFV600E腫瘤在WT小鼠中顯示出加速的排斥反應(yīng)。但在Batf3- /-小鼠中沒(méi)有，說(shuō)明了CCL5或XCL1是通過(guò)cDC1來(lái)起作用的。

圖5F：

圖文描述：在有或沒(méi)有NK細(xì)胞耗竭的WT小鼠中，皮下移植2x105 EMPTY或XCL1的Ptgs1 / Ptgs2 -/- BRAFV600E細(xì)胞，觀察腫瘤的生長(zhǎng)。

結(jié)果分析：在NK細(xì)胞耗竭的小鼠中，過(guò)表達(dá)XCL1的Ptgs1 / Ptgs2- /- BRAFV600E腫瘤比EMPTY細(xì)胞生長(zhǎng)得更慢。提示XCL1介導(dǎo)的cDC1的募集可以部分補(bǔ)償NK細(xì)胞消融引起的腫瘤免疫控制的喪失。

圖5G，H：

圖文描述：將2x106個(gè)EMPTY或過(guò)表達(dá)的CCL5或XCL1的B16-OVA細(xì)胞皮下注射到WT小鼠中，4天后腫瘤內(nèi)cDC1的定量，之后觀察腫瘤生長(zhǎng)。

結(jié)果分析：與Ptgs1 / Ptgs2 -/- BRAFV600E腫瘤類似，過(guò)表達(dá)CCL5和XCL1的B16-OVA腫瘤（不產(chǎn)生PGE2）顯示TDC內(nèi)cDC1的積累增加。過(guò)表達(dá)CCL5和XCL1的B16-OVA腫瘤（不產(chǎn)生PGE2）顯示腫瘤生長(zhǎng)速度降低。

圖5I：

圖文描述：與（G）相同，但使用的是Ptgs2- / -CT26大腸癌細(xì)胞。

結(jié)果分析：在BALB / c小鼠中觀察到由Ptgs2 -/- CT26大腸癌細(xì)胞形成的腫瘤也有類似趨勢(shì)。過(guò)表達(dá)后，顯示腫瘤內(nèi)cDC1的積累增加。過(guò)表達(dá)CCL5和XCL1的Ptgs2 / CT26腫瘤顯示腫瘤生長(zhǎng)速度降低。說(shuō)明CDC1-募集趨化因子CCL5和XCL1可以誘導(dǎo)TME內(nèi)CDC1積累，提高腫瘤免疫控制。

Fig5，PGE2抑制了cDC1對(duì)趨化因子的反應(yīng)；

圖S5A,B：

圖文描述：A移植2x106個(gè)COX充足的對(duì)照BRAFV600E黑色素瘤細(xì)胞EMPTY或過(guò)表達(dá)CCL5或XCL1的細(xì)胞。皮下注射4天后測(cè)定腫瘤內(nèi)cDC1的定量。B 將2x105細(xì)胞移植到WT小鼠中，分別測(cè)量三組腫瘤大小。

結(jié)果分析：進(jìn)一步研究CCL5或XCL1過(guò)表達(dá)是否還誘導(dǎo)了富含COX性腫瘤中的cDC1蓄積，繞過(guò)了PGE2介導(dǎo)的NK細(xì)胞抑制作用。在BRAFV600E腫瘤中，CCL5和XCL1的表達(dá)都不能挽救低的cDC1的豐度（圖S5A），這些腫瘤的生長(zhǎng)與WT小鼠的空轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞相似（圖S5B）。

圖S5C,D：

圖文描述：與（A-B）相同，但使用CT26癌細(xì)胞。

結(jié)果分析：用COX-充足的CT26腫瘤過(guò)表達(dá)CCL5或XCL1進(jìn)行了類似的觀察。因此，單獨(dú)的趨化因子表達(dá)不足以將cDC1募集到產(chǎn)生PGE2的腫瘤中，這表明PGE2不僅抑制NK細(xì)胞產(chǎn)生CCL5和XCL1，而且削弱cDC1對(duì)趨化因子的反應(yīng)性。

圖S5E,F：

圖文描述：體外DC培養(yǎng)的CD103+ cDC1經(jīng)流式細(xì)胞儀(FACS)分選，與來(lái)自COX-sufficient對(duì)照BRAFV600E黑素瘤細(xì)胞的PGE2 (100ng/ml)或條件培養(yǎng)基(CM)孵育16h，然后在體外測(cè)試向重組CCL5(E)或重組XCL1(F)遷移。

結(jié)果分析：與該觀點(diǎn)一致，暴露于來(lái)自產(chǎn)生PGE2的腫瘤的條件培養(yǎng)基（CM）的cDC1向CCL5和XCL1的遷移受到阻滯。

圖S5G,H：

圖文描述：孵育期后，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)通過(guò)RT-PCR或XCR1表面蛋白分析Xcr1（G）或Ccr5（H）mRNA。

結(jié)果分析：此外，將cDC1與產(chǎn)PGE2的細(xì)胞中的CM或合成的PGE2一起孵育，會(huì)發(fā)現(xiàn)Xcr1和Ccr5 mRNA下調(diào)。

圖S5I：

圖文描述：E,F中cDC1上XCR1表面表達(dá)的流式細(xì)胞術(shù)分析。

結(jié)果分析：將cDC1與產(chǎn)PGE2的細(xì)胞中的CM或合成的PGE2一起孵育，會(huì)發(fā)現(xiàn)Xcr1蛋白下調(diào)。

圖S5J：

圖文描述：從對(duì)照或Ptgs1 / Ptgs2 -/- BRAFV600E腫瘤分離的腫瘤內(nèi)cDC1上XCR1表面表達(dá)的流式細(xì)胞術(shù)分析。

結(jié)果分析：從BRAFV600E腫瘤中分離出的cDC 1也有XCR 1下調(diào)的現(xiàn)象。這些數(shù)據(jù)表明，PGE 2可阻斷cDC 1向趨化因子CCL 5和XCL 1遷移的能力，其部分機(jī)制是通過(guò)下調(diào)相應(yīng)的受體。

Fig6，人類癌癥數(shù)據(jù)集的分析揭示了NK細(xì)胞，趨化因子和cDC1之間的密切相關(guān)性；

圖6A：

圖文描述：基于全局基因表達(dá)數(shù)據(jù)（來(lái)自GSE24759的數(shù)據(jù)集）分析38個(gè)人類造血細(xì)胞群中CCL5，XCL1和XCL2的表達(dá)。

結(jié)果分析：探查了XCL2，這是XCL1的旁系同源物，在人類中有，卻沒(méi)有在小鼠中發(fā)現(xiàn)，并且還以很高的親和力結(jié)合XCR1。XCL1和XCL2均在NK細(xì)胞的CD56（通常稱為CD56DIM）子集中表達(dá)。CCL5在CD56 -和CD56 + NK細(xì)胞以及其他免疫細(xì)胞群體（如效應(yīng)和記憶CD8 + T細(xì)胞）中表達(dá)。

圖6B：

圖文描述：熱圖顯示在人類TCGA數(shù)據(jù)集中XCL1，XCL2和CCL5轉(zhuǎn)錄水平之間成對(duì)計(jì)算的皮爾遜相關(guān)值，這些數(shù)據(jù)適用于皮膚皮膚黑色素瘤（SKCM，n = 460），乳腺浸潤(rùn)癌（BRCA，n = 1092），頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（HNSC，n = 518）和肺腺癌（LUAD，n = 506）。

結(jié)果分析：我們觀察到三種趨化因子X(jué)CL 1、XCL 2和CCL 5之間存在顯著的正相關(guān)關(guān)系。與認(rèn)為它們可能都是由相同的瘤內(nèi)細(xì)胞類型所產(chǎn)生的觀點(diǎn)一致。

圖6C：

圖文描述：不同腫瘤中TCGA數(shù)據(jù)集中趨化因子特征與NK細(xì)胞之間的相關(guān)性。

結(jié)果分析：我們?cè)谒兴膫€(gè)TCGA數(shù)據(jù)集中觀察到兩個(gè)基因特征之間的高度顯著正相關(guān)。

圖6D：

圖文描述：基于全局基因表達(dá)數(shù)據(jù)（來(lái)自GSE77671的數(shù)據(jù)集），鑒定人DC子集中的cDC1特異性基因。

結(jié)果分析：分析了以前用作cDC1標(biāo)記物的CCR7，THBD（CD141 / BDCA3），IRF8，ITGAE（CD103），F(xiàn)LT3和ZBTB46，但在分析中顯示出混雜表達(dá)，無(wú)規(guī)律可循。

圖6E：

圖文描述：TCGA數(shù)據(jù)集中特定于cDC1和NK細(xì)胞的基因特征的相關(guān)性。

結(jié)果分析：在所有癌癥類型中，cDC1特征與NK細(xì)胞的基因特征呈高度正相關(guān)。

圖6F：

圖文描述：TCGA數(shù)據(jù)集中趨化因子和cDC1基因特征的相關(guān)性。

結(jié)果分析：在所有癌癥類型中，cDC1特征與趨化因子特征呈高度正相關(guān)。

圖6G：

圖文描述：熱圖顯示TCGA數(shù)據(jù)集中指定特征基因的皮爾遜相關(guān)系數(shù)。

結(jié)果分析：三向相關(guān)性一直很重要，但在黑色素瘤和乳腺癌中最為明顯。

Fig7.NK細(xì)胞和cDC1的基因特征與癌癥患者的生存呈正相關(guān)。

圖7A：

圖文描述：熱圖顯示黑色素瘤患者中NK細(xì)胞特異性基因的有序z轉(zhuǎn)化表達(dá)值。分為NK細(xì)胞特征高和低兩組。

圖7B：

圖文描述：TCGA數(shù)據(jù)集頂部和底部四分位數(shù)的NK細(xì)胞特征基因的表達(dá)。

結(jié)果分析：在所有癌癥類型中，NK特征基因在腫瘤樣品中的較高表達(dá)。

圖7C：

圖文描述：NK細(xì)胞標(biāo)記對(duì)人類癌癥患者總體生存率的最高和最低四分位數(shù)的預(yù)測(cè)價(jià)值。

結(jié)果分析：NK細(xì)胞特征基因與患者存活率顯著相關(guān)，NK表達(dá)較高的患者預(yù)后較好。

圖7D：

圖文描述：熱圖顯示了黑色素瘤患者中cDC1特異性基因的有序z轉(zhuǎn)化表達(dá)值。

結(jié)果分析：同樣，黑色素瘤中也分為cDC1高表達(dá)和低表達(dá)組。

圖7E：

圖文描述：表示的TCGA數(shù)據(jù)集的頂部和底部四分位數(shù)的cDC1特征基因的表達(dá)。

結(jié)果分析：四種腫瘤中，cDC1特征基因在腫瘤樣品中的較高表達(dá)。

圖7F：

圖文描述：cDC1特征基因的最高值和最低值四分位數(shù)對(duì)癌癥患者總生存期的預(yù)后價(jià)值。

結(jié)果分析：cDC1細(xì)胞特征基因與患者存活率顯著相關(guān)，cDC1表達(dá)較高的患者預(yù)后較好。

圖7G：

圖文描述：CLEC9A表達(dá)水平的最高值和最低值四分位數(shù)對(duì)癌癥患者總生存期的預(yù)后價(jià)值。

結(jié)果分析：值得注意的是，單個(gè)cDC1標(biāo)記CLEC9A也可預(yù)后患者的生存，CLEC9A表達(dá)越高，預(yù)后越好。

圖7H：

圖文描述：比較cDC1和CD8 T細(xì)胞標(biāo)志物的p值和危害比，以作為整體存活率的指標(biāo)。

結(jié)果分析：四種腫瘤中，cDC1標(biāo)記可以像CD8 T細(xì)胞信號(hào)一樣有效地預(yù)測(cè)癌癥患者的生存。

04

優(yōu)缺點(diǎn)

優(yōu)點(diǎn)：

1、這篇文章是生信研究、基礎(chǔ)研究、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)合的典型優(yōu)秀文章，我們可以先從生信分析中提示出某種信息再進(jìn)行基礎(chǔ)研究。

2、全文邏輯清晰，思維全面，先后使用了多種小鼠模型以及腫瘤模型，闡述了一種腫瘤共有的特點(diǎn)，提示我們的研究可以不局限于肺癌。

3、作者關(guān)注了一種并不熱門的免疫細(xì)胞，但是研究的非常深入。

缺點(diǎn)：

1、CD8+T細(xì)胞是否參與cDC1的調(diào)控，我們還未可知。

2、未涉及到臨床藥物及耐藥方面的研究。

作者：鐘舒鵬校審：吳鋼