植物根系為微生物提供大量聚集棲息和繁衍的場所。這些微生物及其相互關(guān)系統(tǒng)稱為根系微生物組。根系微生物組伴隨著植物的整個生長周期，幫助植物吸收營養(yǎng)、抵抗病害和適應(yīng)脅迫環(huán)境。根系微生物組研究目前主要以描述性研究為主，重組菌群體系為研究根系微生物組與宿主植物互作的功能和機(jī)制提供了前所未有的機(jī)遇。

中科院遺傳發(fā)育所白洋課題組應(yīng)邀發(fā)表了根系微生物組研究中合成菌群體系的綜述文章Reductionist synthetic community approaches in root microbiome research?？偨Y(jié)了合成菌群體系在植物根系微生物組功能研究中的應(yīng)用。主要包括：一、分離培養(yǎng)根系微生物組菌種資源；二、比較主流植物無菌種植研究體系的優(yōu)缺點(diǎn)；三、合成菌群體系在根系微生物組研究中應(yīng)用的經(jīng)典案例（重現(xiàn)自然土壤的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，研究根系微生物組的功能，研究微生物與微生物之間的關(guān)系）。文章也指出當(dāng)前研究方法的不足，展望了未來需要解決的問題。

白洋課題組長期進(jìn)行植物與根系微生物組互作的研究，近期在Science、Nature Biotechnology 等雜志發(fā)表相關(guān)研究重要成果。該綜述于2019年11月14日在線發(fā)表于Current Opinion in Microbiology 雜志(https:///10.1016/j.mib.2019.10.010)。工程師劉永鑫為該論文第一作者，白洋研究員為通訊作者，在讀博士生秦媛參與了部分工作。該研究得到了中國科學(xué)院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專項(xiàng)、前沿科學(xué)重點(diǎn)研究項(xiàng)目、國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目和中國科學(xué)院微生物組項(xiàng)目的支持。

根系微生物組研究中的合成群落還原法

Reductionist synthetic community approaches in root microbiome research

Current Opinion in Microbiology [6.916]

2019-11-14，Review

原文鏈接：https:///10.1016/j.mib.2019.10.010

摘要

合成群落(Synthetic community，簡稱SynCom)方法，是研究有關(guān)植物如何調(diào)控其微生物群落、以及微生物組如何影響植物生長和健康的功能和機(jī)理的有效手段。微生物的培養(yǎng)和重組在此過程中起著關(guān)鍵作用，這使研究人員能夠在可控的實(shí)驗(yàn)室條件下可重復(fù)研究植物與大部分與植物相關(guān)微生物之間的相互作用。在這里，我們總結(jié)了在植物微生物組研究中使用SynCom實(shí)驗(yàn)的出現(xiàn)、當(dāng)前的成就和未來的機(jī)會，關(guān)注的重點(diǎn)是與植物根相關(guān)的細(xì)菌。

引言

注：··代表強(qiáng)烈推薦的參考文獻(xiàn)；·代表推薦的參考文獻(xiàn)；參考文獻(xiàn)部分也會對這些推薦文獻(xiàn)進(jìn)行簡要介紹

獨(dú)特的微生物組聚集在植物根部，微生物成員來自土壤環(huán)境[1··-3··]，詳見《Nature: 擬南芥根微生物組的結(jié)構(gòu)和組成》。這些微生物在其整個生命周期中與植物相互作用[4,5]，詳見《水稻微生物組時間序列分析》，影響植物的生長[6,7··]，養(yǎng)分吸收[8··，9··]和抗病性[10··-13·]。在過去的十年中，已經(jīng)在模式植物[1··，3··，14]和農(nóng)作物[10··，15··-19]中廣泛研究了根部微生物組的組成。此外，研究人員從各種植物的微生物群落中培養(yǎng)細(xì)菌并建立資源庫，包括擬南芥、水稻（Oryza sativa）、玉米（Zea mays）、番茄（Solanum lycopersicum）、馬鈴薯（Solanum tuberosum）、三葉草（Trifolium pratense）和甘蔗（Saccharum sp.）[8··，10··，18,20··，21··-23]等。培養(yǎng)這些細(xì)菌的最終目標(biāo)是檢查根系微生物群與宿主植物之間相互作用的功能和機(jī)理。在這里，我們討論在實(shí)驗(yàn)性使用合成群落（SynComs）的主要挑戰(zhàn)，即微生物組培養(yǎng)和重組。

從整體主義到還原主義

From holism to reductionism

根系微生物組與宿主植物之間相互作用的研究，架起了微生物生態(tài)學(xué)和植物分子生物學(xué)領(lǐng)域的橋梁。生態(tài)學(xué)研究通常使用整體方法研究根微生物組，這對于揭示自然環(huán)境中根微生物組的狀態(tài)至關(guān)重要。相比之下，使用還原論方法的研究試圖避免不可控制的變量，將根微生物組與植物宿主的相互作用分解為實(shí)驗(yàn)可控制的因素（培養(yǎng)的微生物，營養(yǎng)素，植物基因型等），以了解其功能和機(jī)制[ 24·]（圖1）。兩篇具有開創(chuàng)性的論文在根微生物學(xué)研究中率先提出了還原論的概念[1··，3··]。這些研究的作者在受控條件下和在天然土壤中生長擬南芥植物，以避免風(fēng)，雨和溫度的差異，同時允許植物從天然土壤微生物群落中組裝根微生物組（圖1a，b）。通過大量的生物學(xué)和技術(shù)重復(fù)，兩項(xiàng)研究得出的結(jié)論是：與土體土壤的微生物組相比，擬南芥植物具有獨(dú)特的根系微生物組。此外，Bulgarelli等證明了在實(shí)驗(yàn)室條件下天然土壤中根系微生物群的主要組裝模式與自然田間土壤中的根系微生物群落相似[1··]。

在溫室(受控條件)下研究天然土壤接種物中的根部微生物組的組裝已廣泛用于水稻，擬南芥及其近緣[15··，25·，26·]等物種的根部微生物組研究（圖1b）。減少環(huán)境變化對于有意義的微生物組比較描述至關(guān)重要。但是，為了通過實(shí)驗(yàn)操作微生物組，必須將根微生物組和宿主植物之間的相互作用分解為實(shí)驗(yàn)可控制的因素，例如微生物、植物基因型、營養(yǎng)素和生長條件（圖1c）。這要求研究人員培養(yǎng)特定的微生物[27]。

圖1. 在田間、溫室和實(shí)驗(yàn)室合成群落系統(tǒng)中開展微生物組研究

（a）田間實(shí)驗(yàn)用于探索自然條件下根系微生物組的組裝和變異，溫度，風(fēng)，雨，微生物組和土壤養(yǎng)分等環(huán)境因素?zé)o法控制。

（b）在受控溫室內(nèi)使用天然土壤進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)可避免環(huán)境變化并提供可重復(fù)的結(jié)果。但使用此技術(shù)無法深入剖析微生物群成員和土壤養(yǎng)分。

（c）合成群落(SynCom)方法利用培養(yǎng)的微生物提供獨(dú)特的機(jī)會以獲得完全可重復(fù)的結(jié)果，并研究根部微生物組在植物適應(yīng)性中的功能。

培養(yǎng)和剖析根系微生物組

Cultivating and dissecting the root microbiome

操縱微生物組的方法需要大量收集微生物培養(yǎng)物和植物無菌(axenic)生長系統(tǒng)[20··，28·，29··]。盡管成千上萬的培養(yǎng)微生物已被分離并保藏在一些國際菌種保存中心[30]，但這些微生物是從各種環(huán)境或宿主物種中獲得的，并且可能適應(yīng)當(dāng)?shù)貤l件以及與天然微生物組的其他成分進(jìn)行相互作用。因此，現(xiàn)有分離株可能與研究人員在其新樣品中發(fā)現(xiàn)的微生物在基因型和功能上有所不同，因此可能不適合在給定的天然土壤中剖析植物與根部微生物組之間的相互作用。

高通量細(xì)菌培養(yǎng)為大規(guī)模捕獲和操縱細(xì)菌群落提供了解決方案（圖2a–d）。最近，白洋等建立了用于高通量細(xì)菌培養(yǎng)和鑒定的實(shí)驗(yàn)和分析流程，能夠從在自然土壤中生長的擬南芥植物的根和葉中分離和鑒定了7943個細(xì)菌分離物[20··]。這項(xiàng)技術(shù)主要涉及使用TSB、R2A等相關(guān)培養(yǎng)基以及限制稀釋方法，并輔以細(xì)胞分選和菌落挑選。使用基于454測序的方法的對細(xì)菌分離株進(jìn)行了表征，這使作者能夠鑒定出共同培養(yǎng)的菌株。該方法培養(yǎng)了可重復(fù)存在于擬南芥根和葉微生物組中細(xì)菌類群的50％以上。最近，張婧贏等人使用一種改進(jìn)的鑒定方法鑒定來自水稻根的13,512種細(xì)菌分離株，覆蓋了70％的水稻根細(xì)菌微生物組成員。這種新方法使用Illumina HiSeq2500提高了測序深度，并通過使用兩端條形碼標(biāo)簽(barcode)和每種分離物的獨(dú)立文庫制備避免了嵌合體形成，從而提高了鑒定的準(zhǔn)確性[8··]。這些方法提供了一種剖析特定根微生物組樣品的有效方法，其優(yōu)點(diǎn)是能夠識別共培養(yǎng)的細(xì)菌（即包含一種以上細(xì)菌的細(xì)菌“分離物”）。

為了獲得盡可能多的多樣性，有針對性的分離細(xì)菌（即，標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基不能滿足特定培養(yǎng)要求的細(xì)菌）是對高通量細(xì)菌培養(yǎng)的有效補(bǔ)充?；?6S rRNA基因測序或鳥槍法宏基因組測序的幾種方法可以幫助鑒定合適的專用分離培養(yǎng)基。例如，Oberhardt及其同事開發(fā)了一種工具KOMODO，詳見《NC：16S序列預(yù)測培養(yǎng)基配方》，可以使用細(xì)菌16S rRNA基因序列來預(yù)測所需的分離培養(yǎng)基[31]。另一個可用的數(shù)據(jù)庫中，使用Greengene ID，BugBase數(shù)據(jù)庫可用于獲取詳細(xì)的細(xì)菌特征，例如有氧或無氧生長，從而為所需的培養(yǎng)條件提供指導(dǎo)[32]，詳見《Bugbase預(yù)測16S擴(kuò)增子數(shù)據(jù)表型》。宏基因組學(xué)數(shù)據(jù)或細(xì)菌基因組提供了有關(guān)細(xì)菌碳水化合物代謝和抗生素抗性基因的第二個信息來源，這有助于設(shè)計(jì)富集特定細(xì)菌的分離培養(yǎng)基[33,34]。在宏基因組學(xué)數(shù)據(jù)的指導(dǎo)下，Kwak及其同事使用含有卡那霉素的海洋肉湯培養(yǎng)基成功分離了22種具有番茄抗青枯病的黃桿菌的菌株[10··]，詳見《NBT：根際微生物組抗番茄枯萎病 和 PPT思路梳理》。同時培養(yǎng)基制備技術(shù)也很重要，例如，Kato及其同事報告稱，高壓滅菌的磷酸鹽和瓊脂一起生成H₂O₂，從而減少了最終的菌落數(shù)[35]，詳見《再這么配培養(yǎng)基，你的細(xì)菌都被毒死了！》。未來的培養(yǎng)工作應(yīng)針對培養(yǎng)難以獲得的分類單元（即酸性細(xì)菌，嗜彎曲桿菌，變形桿菌和厭氧分類單元），這些分類單元普遍存在于根系微生物組中，但在收集培養(yǎng)物中并未得到很好的體現(xiàn)。

SynCom實(shí)驗(yàn)中的首次通過表征和分離株的選擇通常使用培養(yǎng)菌株的16S rRNA基因序列與微生物組分析數(shù)據(jù)進(jìn)行交叉比對（圖2e）。在微生物組分析中，與使用97％ 16S rRNA基因序列相似性聚類的操作分類單元（OTU）相比，在UNOISE、DADA2和Deblur分析（主流非聚類方法dada2,deblur和unoise3介紹與比較）中獲得的擴(kuò)增測序變體（ASV，100％16S rDNA序列相似性）提供了更高的分辨率，詳見《擴(kuò)增子分析還聚OTU就真OUT了》。ASV區(qū)分16S rRNA基因中的單核苷酸多態(tài)性。這樣可以更精確地比較培養(yǎng)細(xì)菌和擴(kuò)增子數(shù)據(jù)[36-38]；然而，應(yīng)該指出的是，盡管16S rRNA基因是最廣泛使用的分類標(biāo)記，但并不能揭示細(xì)菌分離物中的所有基因組和功能變異。例如，Karasov及其同事證明了屬于同一OTU的假單胞菌分離株（基于16S rRNA基因序列）在基因組含量和疾病表型水平上表現(xiàn)出明顯的不同[39·]。因此，選擇具有相同16S rRNA基因序列但從不同根系分離，代表不同定殖事件的細(xì)菌菌株，將增加培養(yǎng)的根系微生物組成員的功能多樣性[8··，20··]，如《NBT封面：水稻NRT1.1B基因調(diào)控根系微生物組參與氮利用》中對不同品種來源的相同16S菌種序列各保留一個菌株。

圖2. 合成群落工作流程

Figure 2. SynCom workflow.

a. 采集帶有大量微生物組的植物根系

b. 采用挑單克隆、限制梯度稀釋和流式細(xì)胞分選等方法分離單菌

c. 采用雙向標(biāo)簽的建庫方式采用Illumina對培養(yǎng)組進(jìn)行高能量鑒定，同時對非冗余菌進(jìn)行16S全長Sanger測序

d. 純菌采用甘油冷凍保藏，構(gòu)建的菌種庫可與自然樣品比對可用菌種的比例和相對豐度

e. 根據(jù)不同研究，主要依據(jù)菌種與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的相關(guān)分析、網(wǎng)絡(luò)分類及依賴分類學(xué)分布，來選擇實(shí)驗(yàn)菌種

f. 功能分析。采用單菌或混菌的方法，在無菌體系中接種無菌苗，觀察表型的變化以及定量群落結(jié)構(gòu)的變化

植物無菌培養(yǎng)系統(tǒng)的比較

Comparison of axenic systems

SynComs主要使用三種無菌系統(tǒng)：瓊脂基(agar-based)，黏土基質(zhì)(clay-based)和FlowPot系統(tǒng)，每種系統(tǒng)都有各自的優(yōu)缺點(diǎn)。瓊脂系統(tǒng)是高度人工的，許多因素（如營養(yǎng)水平以及生物和非生物脅迫）均受到控制[40··-42]。與瓊脂系統(tǒng)相比，基于粘土的系統(tǒng)可以更好地模擬土壤條件，因?yàn)檎惩恋馁|(zhì)地類似于土壤。但是，粘土基質(zhì)會影響?zhàn)B分狀況影響，使其難以去除氮或磷酸鹽等特定養(yǎng)分，并且粘土缺乏有機(jī)碳[8··，20··，43··]。FlowPot系統(tǒng)基于高壓滅菌和洗滌過的土壤，因此含有有機(jī)碳。但是在該系統(tǒng)中，營養(yǎng)成分無法控制[7··，29··]。因此，系統(tǒng)的選擇應(yīng)基于實(shí)驗(yàn)的最終目的。

合成群落法重組根系微生物組

Reconstituting root microbiomes using SynComs

利用培養(yǎng)的純菌株，科學(xué)家們能夠根據(jù)自然微生物組模式在無菌系統(tǒng)中合成群落(SynComs)，該模式是通過微生物與植物表型之間的相關(guān)性獲得的[10··]，以及野生型和突變體植物之間根系微生物群落的比較[ 43··]或網(wǎng)絡(luò)分析[7··]（圖2e）。這些方法為驗(yàn)證在自然土壤條件下觀察到的根系微生物組裝配模式、研究根部微生物組對不同環(huán)境條件下植物適應(yīng)性的影響、研究微生物與微生物之間的相互作用、以及微生物基因功能提供了新的機(jī)會[44-46]（圖2f）。

在無菌條件下使用SynComs可為研究人員提供可控的生態(tài)環(huán)境，其中可嚴(yán)格控制微生物、養(yǎng)分和植物基因型，產(chǎn)生可重復(fù)的結(jié)果，可用于對觀察到自然土壤中根部微生物組模式進(jìn)行驗(yàn)證。例如，與自然土壤或含有38個細(xì)菌菌株的煅燒粘土重組系統(tǒng)中生長的野生型植物相比，Lebeis及其同事檢測到水楊酸信號突變體的擬南芥根微生物組發(fā)生了變化[43··]。SynCom實(shí)驗(yàn)中顯示野生型和突變型植物豐度不同的七個細(xì)菌菌株中，有四個屬于自然土壤中野生型和突變型植物豐度差異的科。因此，基于從自然土壤和實(shí)驗(yàn)室合成群落條件下獲得的證據(jù)，作者得出結(jié)論：水楊酸介導(dǎo)的植物先天免疫信號通路在科水平上調(diào)節(jié)擬南芥根微生物組的組裝[43··]。Castrillo及其同事采用了類似的邏輯，他們研究了磷酸鹽饑餓途徑對擬南芥根微生物組建立的影響[40··，41]。這些作者確定了天然土壤和使用木村培養(yǎng)基(Murashige & Skoog)瓊脂平板進(jìn)行的SynCom實(shí)驗(yàn)中，均表現(xiàn)為野生型植物和幾種磷酸鹽饑餓突變體之間差異的根部微生物組組成。

此外，SynCom利用測序培養(yǎng)細(xì)菌的方法提供了簡單且可重現(xiàn)的系統(tǒng)，用于研究根代謝物（例如三萜，芳香酸，香豆素和camalexin）在復(fù)雜自然土壤中對根微生物組與宿主植物之間相互作用的作用[ 47··-49·-51]?？傊?，在受控條件下使用SynComs進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)可以驗(yàn)證根微生物組的裝配模式，并補(bǔ)充了在自然土壤條件下根微生物組的研究。

用SynCom在無菌系統(tǒng)中接種無菌植物的主要好處是能夠研究不同環(huán)境條件下根部微生物組的功能。例如，Duran及其同事在基于土壤的FlowPot系統(tǒng)中用不同的SynCom（包括細(xì)菌，真菌和卵菌）接種了無菌的擬南芥植物，并發(fā)現(xiàn)根細(xì)菌微生物組在天然土壤中保護(hù)擬南芥植物免受絲狀真核生物（真菌和卵菌）的侵害[7··]。Castrillo及其同事在低磷酸鹽條件下用SynComs接種了無菌植物，結(jié)果表明細(xì)菌接種顯著增加了植物的磷酸鹽饑餓反應(yīng)，而磷酸鹽饑餓途徑的主要調(diào)控因子直接抑制了植物的先天免疫系統(tǒng)[40··]。此外，有研究表明少量的SynComs的特征足以預(yù)測微生物組在擬南芥對磷酸鹽利用中的影響[41]。最近的一項(xiàng)后續(xù)研究表明，伯克霍爾德氏菌與植物競爭磷酸鹽的利用，加劇了植物磷酸鹽的饑餓[42]。張婧贏及其同事利用從秈稻和粳稻品種的微生物組中培養(yǎng)出來的細(xì)菌，發(fā)現(xiàn)水稻根系微生物組促進(jìn)了植物對有機(jī)氮的利用[8··]，詳見《NBT封面：水稻NRT1.1B基因調(diào)控根系微生物組參與氮利用》?；趯σ吧共『鸵赘蟹哑贩N根系微生物群的相關(guān)性分析，Kwak及其同事成功地培育了一種目標(biāo)黃桿菌，并證明了將其接種到番茄根中后能增強(qiáng)抗枯萎病能力[10··]，詳見《NBT：根際微生物組抗番茄枯萎病 和 PPT思路梳理》。培養(yǎng)的假單胞菌進(jìn)行基因組分析，鑒定了脂肽的生物合成和群體感應(yīng)是致病性和共生根細(xì)菌之間的主要基因組差異[46]，以及根際細(xì)菌逃避植物防御或誘導(dǎo)植物易感性所需的基因[44]。，45]。這些實(shí)例證明了SynComs或培養(yǎng)的微生物在闡明根微生物組在不同環(huán)境條件下對植物適應(yīng)性的影響等方面的實(shí)用性。

培養(yǎng)的微生物和SynCom方法為探索微生物與微生物之間的相互作用和微生物基因功能提供了獨(dú)特的機(jī)會。牛犇及其同事使用瓊脂系統(tǒng)和由從玉米根部培養(yǎng)的七個細(xì)菌菌株組成的SynCom，顯示出泄殖腔腸桿菌(Enterobacter cloacae)的去除導(dǎo)致玉米幼苗根部微生物群落結(jié)構(gòu)的完全喪失，證明了微生物－微生物相互作用的重要性和微生物組中關(guān)鍵物種的存在[52]，詳見《PNAS：人工構(gòu)建玉米極簡微生物組》。Duran及其同事對培養(yǎng)的根源細(xì)菌，真菌和卵菌進(jìn)行了大規(guī)模的二元互作分析，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌對絲狀真核生物的生物防治活性是冗余的性狀，可以維持根微生物組的相互平衡[7··]，詳見《Cell ：根部微生物跨界的互作促進(jìn)擬南芥生存》 。Levy及其同事發(fā)現(xiàn)，與Acidovorax的delta-Hyde1和VI型分泌系統(tǒng)（T6SS）突變體相比，野生型Acidovorax與大腸桿菌和6種細(xì)菌分離株共培養(yǎng)的存活率降低了10²-10⁶倍，表明Hyde和T6SS介導(dǎo)的抗菌活性可用于調(diào)控微生物組[21··]，詳見《NG：微生物是如何適應(yīng)植物的？評論文章 正文解讀》。這些研究揭示了培養(yǎng)的微生物在剖析微生物與微生物相互作用中的價值。

結(jié)論

Conclusions

由于土壤環(huán)境的復(fù)雜性，當(dāng)前的SynCom方法只能部分模擬自然條件。SynCom系統(tǒng)的低復(fù)雜性可能意味著缺少一些重要的微生物組成員或營養(yǎng)物質(zhì)。然而，在進(jìn)行微生物培養(yǎng)后使用SynComs在無菌系統(tǒng)中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，這使我們能夠闡明根系微生物組與植物表型之間的因果關(guān)系，并剖析微生物組成員在自然土壤條件下的相互作用。為了進(jìn)一步揭示根部微生物組在植物生長和健康中的功能和機(jī)制，需要更多的培養(yǎng)微生物、基因組測序、改進(jìn)的無菌苗種植系統(tǒng)以及對不同功能微生物組成員的系統(tǒng)研究。