HBV感染是一個(gè)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，全球約有24億人感染HBV，我國目前大約有8600萬慢性HBV感染者。HBV一般認(rèn)為是通過內(nèi)吞作用進(jìn)入人體肝細(xì)胞，然后將病毒基因組轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核中，經(jīng)由多個(gè)尚未明確的加工過程，在細(xì)胞核中雙鏈均未共價(jià)連接的松弛環(huán)狀DNA(relaxed circular DNA，rcDNA) 形成了雙鏈共價(jià)連接的共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)。HBV cccDNA是編碼所有 HBV RNA的唯一模板，它對(duì)病毒復(fù)制的起始和維持是必需的，是導(dǎo)致病毒持續(xù)感染和復(fù)發(fā)的主要原因，從慢性HBV感染的肝細(xì)胞中清除HBV cccDNA被認(rèn)為是實(shí)現(xiàn)根除HBV持續(xù)感染的關(guān)鍵。在抗病毒治療之前、期間和之后監(jiān)測HBV cccDNA對(duì)于慢性乙型肝炎患者的療效評(píng)估極為重要。此外,隨著靶向HBV cccDNA的抗HBV新藥研發(fā)的不斷推進(jìn)，也迫切需要準(zhǔn)確而靈敏的HBV cccDNA檢測方法，以評(píng)價(jià)其療效。Southern印跡方法被認(rèn)為是HBV cccDNA檢測的經(jīng)典的方法。與常用的PCR方法相比, Southern印跡方法極為復(fù)雜, 成本高，且耗時(shí)，不適合臨床應(yīng)用。近20年來國內(nèi)外已經(jīng)報(bào)道了一些HBV cccDNA的檢測方法，包括選擇性PCR、競爭性PCR、Invader法、原位雜交等，但在敏感度和特異度方面仍存在一定的不足。近年來，又陸續(xù)發(fā)展了一些新的HBV cccDNA檢測方法，如引入酶切的實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR)法、磁珠捕獲雜交法、滾環(huán)擴(kuò)增結(jié)合原位雜交法、數(shù)字PCR法和單細(xì)胞內(nèi)HBV cccDNA檢測等方法，本文就這些最新的方法學(xué)進(jìn)展作簡要的介紹。

1  引入酶切的qPCR檢測HBV cccDNA

qPCR檢測HBV cccDNA的基本原理就是設(shè)計(jì)HBV cccDNA特異性引物跨越HBV病毒基因組中的缺口區(qū)域以避免直接擴(kuò)增rcDNA等，但是它們在選擇性擴(kuò)增HBV cccDNA上并不是絕對(duì)的，其原因是線性單鏈由于引物延伸形成的產(chǎn)物在短重疊區(qū)域內(nèi)自退火，由此產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物用于進(jìn)一步指數(shù)擴(kuò)增的線性模板與 HBV cccDNA衍生產(chǎn)物無法進(jìn)行區(qū)分。與非選擇性引物不同，HBV cccDNA引物在優(yōu)化的PCR程序中確實(shí)顯示出一定的特異性，但是當(dāng)與rcDNA共存時(shí)，這不能保證擴(kuò)增HBV cccDNA絕對(duì)的特異性。

為了提高檢測特異度，2004年前后，一些研究者如Zoulim團(tuán)隊(duì)開始使用不降解質(zhì)粒的ATP依賴DNA酶（PsD）來處理樣本。PsD是一種最初用于從質(zhì)粒制備物中去除細(xì)菌染色體DNA的酶，優(yōu)先水解雙鏈線性DNA，它對(duì)線性和閉環(huán)單鏈DNA具有較低效率，對(duì)HBV cccDNA和帶切口的環(huán)狀雙鏈DNA也沒有活性。盡管如此，有研究者稱PsD可使rcDNA等其他形式的HBV DNA降低一個(gè)數(shù)量級(jí)，而可保持HBV cccDNA的含量不變。一些學(xué)者對(duì)酶切方法處理用于HBV cccDNA檢測的標(biāo)本提出質(zhì)疑，主要考慮到增加酶切步驟，可能使標(biāo)本稀釋，同時(shí)酶切反應(yīng)液中的成分也可能抑制PCR反應(yīng)，會(huì)增加假陰性結(jié)果。

直到2010年，Nassal等研究表明PsD不能消化rcDNA，Southern印跡表明PsD消化鴨乙型肝炎病毒（DHBV）感染的肝細(xì)胞中提取的總DNA，并沒有導(dǎo)致完整rcDNA去除。這可能是由于增加了染色體DNA作為PsD的競爭底物的競爭；此外PsD水解短雙鏈線性DNA效果較差，這意味著當(dāng)樣本中存在的總基因組DNA時(shí)，PsD的作用受到限制。

2017年Hu課題組發(fā)現(xiàn)了3’端核酸外切酶Exonuclease(Exo) Ⅰ和Exo Ⅲ可用于降解所有含開放3’端的DNA而保留雙鏈的閉合環(huán)狀DNA。本課題組也建立了一種HBV cccDNA定量檢測方法, 并通過AD38細(xì)胞系、動(dòng)物模型和肝組織等樣本證實(shí)了Exo Ⅰ & Ⅲ降解消化作用，結(jié)果表明這種核酸酶的處理方法能夠降解HBV cccDNA以外的HBV DNA，此法改進(jìn)并提升了HBV cccDNA 檢測的敏感度和特異度。

2018年Stephan團(tuán)隊(duì)證實(shí)qPCR選擇性引物的胞漿顯示信號(hào)要比其他非特異性引物的擴(kuò)增信號(hào)低36.8倍。通過胞漿DNA和細(xì)胞核DNA的擴(kuò)增比較，沒有HBV cccDNA引物顯示出絕對(duì)的特異度。隨后作者使用來自體外感染的細(xì)胞將T5 Exo、Exo Ⅰ、Exo Ⅲ、Exo Ⅰ & Ⅲ和PsD處理后直接進(jìn)行了比較，并進(jìn)行Southern印跡和qPCR。結(jié)果顯示：T5 Exo和Exo Ⅲ去除胞質(zhì)HBV DNA復(fù)制中間體的效果基本相似。通過實(shí)時(shí)PCR同時(shí)定量樣本顯示出Exo Ⅲ去除了98％，T5 Exo去除97％和Exo Ⅰ&Ⅲ去除99％的總HBV DNA。相比之下Exo Ⅰ和PsD效率較低，只是Exo Ⅰ略有增強(qiáng)了Exo Ⅲ的活動(dòng)。該文有力支持T5 Exo或Exo Ⅲ純化HBV cccDNA有較好的效果。

2  磁珠捕獲雜交法檢測HBV cccDNA

因?yàn)镠BV cccDNA存在含量低和結(jié)構(gòu)復(fù)雜等特性，HBV cccDNA的選擇性分離和富集是必需的。磁性顆粒已被廣泛應(yīng)用于從復(fù)雜混合物中分離核酸。核酸的選擇性提取對(duì)于從樣本中分離靶DNA或RNA是必不可少的。該方法通常使用用鏈霉抗生物素蛋白或短寡核苷酸功能化的磁性顆粒。磁珠表面可以通過生物結(jié)合技術(shù)以各種方式進(jìn)行修飾，并且雜交效率與溶液中的相似，優(yōu)于使用其他固定固體支持物的雜交效率。2015年，磁性納米粒子首次被引入對(duì)特定的HBV cccDNA捕獲，用這種方法捕獲的HBV cccDNA通過變性釋放并進(jìn)一步用于傳統(tǒng)的qPCR。使用反向微乳液法合成磁珠，然后用鏈霉抗生物素蛋白(SA)修飾。通過SA修飾二氧化硅包覆的納米顆粒制備功能化納米顆粒，并將顆粒與生物素標(biāo)記的探針偶聯(lián)，以利用SA與生物素的極高親和力相互作用。設(shè)計(jì)靶向rcDNA缺口兩側(cè)的選擇性探針并用其標(biāo)記生物素在5’末端。功能化的納米顆粒與熒光標(biāo)記的寡核苷酸靶標(biāo)雜交，磁性納米顆粒-SA-生物素-HBV cccDNA探針復(fù)合物經(jīng)過優(yōu)化，并證明可與HBV cccDNA特異性雜交。在樣品溶液中的HBV cccDNA與復(fù)合物雜交后，洗去上清液，并加入qPCR組分。通過高溫變性將HBV cccDNA與復(fù)合物分離，然后進(jìn)行常規(guī)PCR定量。通過磁捕獲雜交富集HBV cccDNA，減少了HBV cccDNA富集對(duì)rcDNA的干擾，從而提高了qPCR檢測HBV cccDNA的特異度。該方法捕獲探針的長度可能影響相同雜交區(qū)間中HBV cccDNA捕獲的效率，它也不能捕獲所有HBV cccDNA分子，但檢測濃度和預(yù)期濃度之間的差異在可接受的范圍內(nèi)，此外該方法所需的材料特殊，成本比qPCR更高。

3  滾環(huán)擴(kuò)增（RCA）結(jié)合原位PCR（IS-PCR）法

2008年，Margeridon等首先應(yīng)用RCA定性探測HBV cccDNA。Zhong等將RCA與實(shí)時(shí)PCR結(jié)合起來提高了檢測HBV cccDNA的靈敏度。用Phi29 DNA聚合酶設(shè)計(jì)4對(duì)引物用于RCA，然后RCA產(chǎn)品作為進(jìn)一步實(shí)時(shí)PCR的模板。RCA的引入大大提高了HBV cccDNA檢測的靈敏度和特異度，并最大限度地降低了整合HBV DNA的干擾，這在經(jīng)典qPCR中被忽略了。到目前為止，大多數(shù)HBV cccDNA定量方法還未能揭示HBV cccDNA在肝組織中的分布和定位。為了解決這個(gè)問題，2014年Zhong等進(jìn)一步將RCA和IS-PCR結(jié)合組合在FFPE肝組織中檢測HBV cccDNA。將組織切成切片，切片用HE染色、脫蠟、蛋白酶K和PSAD消化。在RCA之前進(jìn)行。在RCA處理后，將在5’-末端用地高辛標(biāo)記的HBV cccDNA選擇性引物和其他PCR組分加入組織載玻片中，將載玻片密封，包封并放入熱循環(huán)儀中進(jìn)行PCR。在IS-PCR后立即將載玻片固定、滲透、封閉、與抗地高辛堿性磷酸酶綴合的抗體一起溫育并顯現(xiàn)。最后，將載玻片復(fù)染并安裝用于顯微鏡檢查。盡管原位PCR可能導(dǎo)致擴(kuò)增的DNA擴(kuò)散到鄰近的細(xì)胞，交聯(lián)的組蛋白或其他HBV cccDNA結(jié)合蛋白，每種細(xì)胞可以很容易地檢測到兩個(gè)拷貝的HBV cccDNA。但是該方法比較復(fù)雜費(fèi)時(shí)。

4  數(shù)字PCR檢測HBV cccDNA

微滴數(shù)字PCR(ddPCR)是一種新的不依賴于外部校準(zhǔn)曲線的高敏感和特異度的分子檢測方法。ddPCR技術(shù)是基于PCR值和泊松統(tǒng)計(jì)有限稀釋，稀釋后，PCR混合物被分成更小部分，每個(gè)反應(yīng)都經(jīng)過獨(dú)立測試以評(píng)估單分子中靶核酸的數(shù)量，靶核酸的絕對(duì)數(shù)量在原始樣本中可以通過泊松計(jì)算陽性率與總分區(qū)的比率統(tǒng)計(jì)。通過微滴化技術(shù)來實(shí)現(xiàn)數(shù)字PCR，本質(zhì)上數(shù)字PCR采用終點(diǎn)檢測的方法實(shí)現(xiàn)對(duì)核酸分子(DNA與RNA)數(shù)目的絕對(duì)定量。2015年Mu等研究結(jié)果表明，應(yīng)用ddPCR結(jié)合PsD酶預(yù)處理和特異性引物能夠精確檢測HBV cccDNA的單拷貝，使其成為目前已經(jīng)報(bào)道 HBV cccDNA檢測中的最靈敏和準(zhǔn)確的方法。但是，當(dāng)模板數(shù)量大于106個(gè)拷貝時(shí)，實(shí)際值偏離理論值。因?yàn)樵谳^高的目標(biāo)濃度下由于正液滴飽和引起ddPCR顯示相對(duì)較窄動(dòng)態(tài)范圍，形成泊松算法無效。盡管如此，HBV cccDNA在患者體內(nèi)一直處于相對(duì)較低水平，因此絕大多數(shù)患者和研究樣本屬于ddPCR可檢測的范圍，相比qPCR提供的結(jié)果，ddPCR可以獲得更高的靈敏度。與能夠檢測超過108的qPCR系統(tǒng)相比，ddPCR能夠不依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測極低濃度的HBV cccDNA模板，在精確定量樣品非常低的拷貝數(shù)時(shí)是非常有用工具。這個(gè)屬性特別適用于在抗病毒治療期間定量監(jiān)測肝臟活組織中HBV cccDNA波動(dòng)的水平。2018年，意大利研究者Caviglia等使用ddPCR檢測隱蔽感染患者HBV cccDNA水平，研究發(fā)現(xiàn)50%左右的受試者存在隱蔽感染；隱蔽感染者中又有50%左右的患者通過ddPCR檢測出了HBV cccDNA。選擇性ddPCR在檢測HBV cccDNA的靈敏度和精密度方面優(yōu)于普通qPCR，尤其是低水平病毒載量檢測方面。ddPR與qPCR系統(tǒng)相比，盡管兩者使用相同的引物和探針，但ddPCR是精確定量更有價(jià)值的工具，檢測極低濃度的能力和高重復(fù)性是ddPCR獨(dú)有的優(yōu)勢。

5  單細(xì)胞的HBV cccDNA檢測

當(dāng)今一場新興的研究正在生物學(xué)界興起，一系列研究單細(xì)胞生物學(xué)的成果不斷涌現(xiàn)，它們正在促使科學(xué)家以創(chuàng)新的視角重新審視一些傳統(tǒng)的研究領(lǐng)域。當(dāng)生物研究真正的問題取決于于單細(xì)胞的功能時(shí)，對(duì)大量細(xì)胞進(jìn)行總體分析是很難奏效的。我們知道異質(zhì)性是細(xì)胞的天然特性之一，那些看似相同的一群細(xì)胞，其內(nèi)部有可能存在千差萬別。HBV cccDNA檢測過去主要集中在肝內(nèi)細(xì)胞總的HBV cccDNA上，基本沒有考慮肝內(nèi)單細(xì)胞的HBV cccDNA。2018年劉松梅等建立的HBV cccDNA選擇性微滴式數(shù)字PCR（ddPCR）方法用于單細(xì)胞等的檢測，該研究分離單個(gè)HepG2.15細(xì)胞的方法是：細(xì)胞在用磷酸鹽緩沖液洗滌后，將105個(gè)細(xì)胞/ml重懸于磷酸鹽緩沖鹽水中，然后在Transferman NK2顯微操作器上使用10 μm轉(zhuǎn)移器獲取單細(xì)胞。該研究并沒有研究臨床樣本的單細(xì)胞HBV cccDNA。單細(xì)胞分析已經(jīng)漸漸滲透生物醫(yī)學(xué)的相關(guān)領(lǐng)域，隨著相關(guān)技術(shù)的不斷進(jìn)步，它將繼續(xù)推動(dòng)基礎(chǔ)和臨床研究協(xié)同發(fā)展。從某種意義上說，在未來人類的健康將很大程度上取決與我們對(duì)于自身細(xì)胞的深度了解，因?yàn)椋?xì)胞是構(gòu)成生命基本單元，一切問題的根本都將歸結(jié)于細(xì)胞本身。

6  總結(jié)與展望

大量研究表明，HBV cccDNA是慢性乙型肝炎持續(xù)感染的元兇，作為病毒轉(zhuǎn)錄的模板，HBV cccDNA在宿主肝細(xì)胞內(nèi)以微染色體的形式存在。由于HBV cccDNA在患者肝臟中的水平極低，傳統(tǒng)的分子生物學(xué)方法很難檢測。目前，針對(duì)HBV cccDNA檢測的新方法有qPCR、磁珠雜交捕獲法、RCA結(jié)合IS-PCR和數(shù)字PCR等。qPCR包括數(shù)字PCR等主要借助和引物跨缺口設(shè)計(jì)和酶處理來特異性檢測HBV cccDNA；磁珠雜交捕獲主要優(yōu)勢是特異性提取捕獲HBV cccDNA；RCA結(jié)合IS-PCR提高了檢測HBV cccDNA的特異度；單細(xì)胞的HBV cccDNA研究還在起步階段。隨著精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的到來，將可能有更多的方法應(yīng)用于HBV cccDNA的檢測，準(zhǔn)確而靈敏的HBV cccDNA檢測方法對(duì)乙型肝炎的預(yù)測和早期診斷，靶向治療以及治療效果的評(píng)估有重要的臨床意義。