近日，Nature雜志發(fā)表了一篇題為“Small molecule combats cancer-causing KRAS protein at last.”(圖1)的文章。
△圖1、Small molecule combats cancer-causing KRAS protein at last 在追遍關(guān)于“RAS”的前世今生及其研究進(jìn)展并成文后，本文作者對(duì)該方向進(jìn)行了回顧性綜述。希望對(duì)行走在抗“RAS”癌變路上以及對(duì)將要入門的同仁有所幫助。RAS基因家族包括KRAS、NRAS 和 HRAS，1982年，Weinberg等人在人類膀胱癌細(xì)胞（T24/EJ）中發(fā)現(xiàn)了突變激活的RAS基因—HRAS，此次發(fā)現(xiàn)的基因突變是繼20世紀(jì)60年代Harvey和Kirsten等人發(fā)現(xiàn)老鼠腫瘤基因HRAS和KRAS后，首次發(fā)現(xiàn)的人的突變基因。隨著對(duì)癌癥基因組的測(cè)序研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)RAS與癌癥關(guān)系密切，是最常見的致癌基因。在COSMIC數(shù)據(jù)庫中僅除神經(jīng)系統(tǒng)和腹膜、肝臟、食道等幾項(xiàng)腫瘤中沒有見到RAS家族的身影外，其他幾十種癌癥中全部包含RAS突變，而KRAS突變是最常見的基因突變。占RAS突變的85%，該突變?cè)谝认侔┲姓急茸罡撸_(dá)到了54%（圖2），其次為結(jié)腸癌和女性生殖道腫瘤，分別為32%和25%，肺癌為15%。最近的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，KRAS通過RNA剪接表達(dá)的稱為KRAS4B的蛋白能夠間接的抑制Wnt通路，而致使某些細(xì)胞具有干細(xì)胞特性，而其他兩種亞型則不具備這種功能，這可能也是KRAS在人類腫瘤中具有更高突變概率的原因，從癌癥的進(jìn)化角度來說突變更利于癌癥的發(fā)生，也正因?yàn)檫@種原因大多數(shù)關(guān)于RAS的生物學(xué)研究以及抗腫瘤藥物均以KRAS突變展開。
△圖2、最常見的前20個(gè)致癌基因 RAS蛋白為什么會(huì)被冠以“Undruggable”的名號(hào)，這個(gè)就需要從它的結(jié)構(gòu)、原理和功能說起 。RAS基因編碼的RAS蛋白是一種21kDa大小，具有與鳥苷三磷酸（GTP）/鳥苷二磷酸 （GDP）結(jié)合活性的膜蛋白，位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)。其作用相當(dāng)于分子開關(guān)，正常情況下與GDP結(jié)合時(shí)處于非活化狀態(tài)，當(dāng)接收到刺激信號(hào)后，RAS蛋白與細(xì)胞內(nèi)的GTP結(jié)合，調(diào)節(jié)其下游信號(hào)通路中的效應(yīng)蛋白進(jìn)入活性狀態(tài)，從而參與跨膜信號(hào)的傳遞過程。在膜相關(guān)的酪氨酸激酶和核苷酸交換因子的作用下，GTP被迅速水解成GDP，RAS重新與GDP結(jié)合使信號(hào)處于非活化的的狀態(tài)。RAS處于各種信號(hào)通路的中樞位置，下游控制的通路包括Raf、PI3K和RalGDS等；RAS在分子水平上可以調(diào)控蛋白質(zhì)的合成，基因轉(zhuǎn)錄等過程；細(xì)胞水平上影響細(xì)胞形狀、生長(zhǎng)、分化、凋亡等。RAS既可以在這些腫瘤基因的下游傳遞放大信號(hào)，也可以反饋增強(qiáng)它們的致癌功能。RAS作為原癌基因，一旦被激活就成為致癌基因。最常見的激活方式是基因的錯(cuò)義突變，基因突變導(dǎo)致RAS蛋白空間結(jié)構(gòu)的改變，使RAS持續(xù)保持與GTP結(jié)合的活化狀態(tài)，不斷激活其下游的信號(hào)通路。除RAS的持續(xù)活化狀態(tài)，也有pRb和p53的功能缺失是致癌的另外兩個(gè)主要因素，他們是目前已知的腫瘤基因突變最多的三個(gè)基因。pRb和p53是腫瘤抑制基因，導(dǎo)致癌癥的因素往往是蛋白缺失或功能異常，很難找到藥物直接干預(yù)，因此RAS成為了眾矢之的。RAS蛋白是由188或189個(gè)氨基酸組成，它的第一個(gè)結(jié)構(gòu)域含有166個(gè)氨基酸，該結(jié)構(gòu)域在各個(gè)亞型中高度保守。RAS蛋白氨基酸氨基酸序列差異主要位于C末端，該結(jié)構(gòu)域則高度可變，結(jié)構(gòu)生物學(xué)揭示RAS蛋白表面類似一個(gè)光滑的圓球，缺少藥物結(jié)合的靶向“凹陷”和“裂縫”。這就是RAS被冠以“Undruggable”的最主要原因。RAS基因作為重要的癌癥基因，自發(fā)現(xiàn)以來已經(jīng)過了30多年研究。尤其是KRAS基因在人類癌癥中的高突變率及其在腫瘤發(fā)展中所發(fā)揮的重要推動(dòng)作用，使其成為腫瘤分子靶向治療的理想靶點(diǎn)之一。目前，靶向治療RAS的主要方向有以下幾個(gè)：第一，直接抑制RAS；第二，干擾RAS與下游效應(yīng)分子的結(jié)合和阻斷下游信號(hào)通路。第三，阻斷RAS蛋白在細(xì)胞膜上的定位，第四，合成致死方式與RAS基因相互作用。
相比于上下游抑制的間接方式，研究人員似乎喜歡直接抑制。首先研究人員從ATP競(jìng)爭(zhēng)型激酶抑制劑的成功研發(fā)中得到提示，試圖找到能與GTP競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合RAS的化合物。但由于GTP與RAS在及其微量的情況下有超高的親和性，使得競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的研發(fā)變得異常困難。正如上文中提到的RAS與GTP的結(jié)合、激活是由膜相關(guān)的絡(luò)氨酸激酶和核苷酸交換因子等共同作用的。因此，研究者們?cè)噲D抑制RAS-GTP的核苷酸交換而阻止細(xì)胞的癌變，1997年，Taveras[1] 等人通過計(jì)算機(jī)模擬的方法篩選了多種化合物與GTP競(jìng)爭(zhēng)RAS的核苷酸結(jié)合位點(diǎn)，這些化合物雖然能夠抑制RAS突變細(xì)胞的生長(zhǎng)，但均含有羥胺，而羥胺的代謝穩(wěn)定性差且毒性強(qiáng)，最終導(dǎo)致該系列化合物不能成為理想的候選藥物。此外，也曾有研究人員試圖阻斷RAS與GTP酶激活蛋白的相互作用而抑制RAS的活化，但由于其缺乏特異性的靶向作用，導(dǎo)致正常RAS蛋白功能異常，對(duì)機(jī)體會(huì)產(chǎn)生較強(qiáng)的毒副作用。為了能特異性地抑制突變RAS蛋白的功能，研究者們也在不斷尋找活化的RAS和非活化的RAS蛋白之間的結(jié)構(gòu)差異來研發(fā)新型小分子藥物。2013年,Ostrem[2]等人，首次報(bào)道了一類小分子化合物，該化合物能不可逆的與非小細(xì)胞肺癌中最常見的KRASG12C突變體的12位突變后的半膚氨酸殘基形成共價(jià)結(jié)合。結(jié)構(gòu)生物學(xué)發(fā)現(xiàn)，在該突變體中存在一個(gè)“小空穴”，這是在RAS蛋白結(jié)構(gòu)中從未見到的空穴，這類小分子化合物能夠穩(wěn)定的結(jié)合在該空穴處，從而改變KRASG12C的親和性，使其對(duì)GDP更具親和力，達(dá)到抑制KRAS[3]活性的效果。這一靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)在抗KRAS突變過程中具有“里程碑”的意義，為KRAS靶向抑制劑的開發(fā)工作提供了新的思路。其后，多個(gè)研究小組分別以KRASG12C為靶點(diǎn)和成了GDP類似物。包括靶向12、13、61位密碼子突變位點(diǎn)的化合物。最近，安進(jìn)公司公布的AMG-510就是以KRASG12C為靶點(diǎn)的直接抑制藥物，盡管到目前為止，對(duì)KRAS直接靶向的作用的嘗試已經(jīng)顯示出有一定的效果，但進(jìn)入臨床仍然有很長(zhǎng)的路要走，例如如何提高藥物與靶點(diǎn)的結(jié)合力或親和力，再如RAS中是否還存在其他更理想的結(jié)合位點(diǎn)，以及不同結(jié)合位點(diǎn)的作用機(jī)制等。研究人員在研究直接抑制的作用的同時(shí)也在嘗試切斷RAS與GTP下游效應(yīng)分子結(jié)合，干擾細(xì)胞生長(zhǎng)信號(hào)傳遞促使細(xì)胞凋亡,達(dá)到癌癥治療的效果。研究人員發(fā)現(xiàn)，GTP與RAS的結(jié)合物存在著至少兩種不同的構(gòu)象，并且不同構(gòu)象之間的相互轉(zhuǎn)換速度以毫秒為單位。目前對(duì)這些不同構(gòu)象與RAS蛋白生理學(xué)功能之間的聯(lián)系仍然存在諸多爭(zhēng)議，雖然經(jīng)證實(shí)其中某個(gè)構(gòu)象之間存在一定的“凹陷”可以作為藥物的靶點(diǎn)，但大多數(shù)該類化合物均屬于有機(jī)金屬難以成藥，且親和力較低也是需要解決的問題。另一個(gè)可阻斷RSA-GTP與下游效應(yīng)分子結(jié)合的方式是直接靶向結(jié)合下游效應(yīng)分子，間接阻止效應(yīng)分子與RAS-GTP的結(jié)合。由此，不同的研究人員設(shè)計(jì)過不同的抗體類藥物和多肽類小分子抑制劑。1998年，Darlene[4] 等人曾經(jīng)設(shè)計(jì)出一種只有7種氨基酸的小分子化合物抑制RAS-GTP與RAF結(jié)合的抑制劑，按照文獻(xiàn)報(bào)道上所說，其篩選的21種多肽抑制劑中，僅有1種體外實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)尚可，但由于其效果和親和力差也未能得到進(jìn)一步開發(fā)。關(guān)于此種抑制劑目前多數(shù)還處于機(jī)制研發(fā)或?qū)嶒?yàn)室研發(fā)階段，能否進(jìn)入臨床仍有待進(jìn)一步研究。由于直接靶向下游分子結(jié)合的難度較大，人們開始嘗試開發(fā)RAS下游信號(hào)通路為靶點(diǎn)的抑制劑，這一類抑制劑似乎成為抑制RAS突變的突破口，現(xiàn)已經(jīng)是RAS突變癌癥治療的最有前景的藥物。被人們研究最深入最廣泛的兩條下游通路分別是RAF/MAPK、PI3K/AKT/mTOR。從該類抑制藥物整體研究進(jìn)展和臨床數(shù)據(jù)來看，單一靶點(diǎn)抑制效果并不好。原因是抑制一條通路激活后，往往會(huì)造成旁路的過度激活。雖然這兩條通路抑制劑在臨床上沒有取得卓越的成效，但也不能否認(rèn)這兩條通路抑制劑在RAS突變腫瘤中的意義。例如：FDA已經(jīng)批準(zhǔn)上市的Vemurafenib、selumetinib、Trarnetinib。其中Vemurafenib曾在被美國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)評(píng)選為2011年臨床腫瘤5項(xiàng)重大進(jìn)展之一，但主要作用并不在RAS突變腫瘤中，而是用于BRAF突變的黑色素瘤。RAS下游的另一條被廣泛研究的通路是PI3K/AKT/mTOR，目前至少98項(xiàng)臨床試驗(yàn)針對(duì)PI3K激酶信號(hào)通路抑制劑，66項(xiàng)針對(duì)ATK激酶信號(hào)通路抑制劑，其中包括多個(gè)已經(jīng)上市的多種藥物，例如：貝伐埃羅替尼和吉非替尼、派姆單抗、曲米替尼等。RAS蛋白在細(xì)胞膜上發(fā)揮其生物學(xué)活性作用，需要細(xì)胞質(zhì)中合成前體蛋白后經(jīng)歷一系列的修飾過程，這一系列蛋白翻譯后的修飾過程需要一系列的酶的催化作用（如圖3）。由于其整個(gè)酶催化機(jī)制較復(fù)雜，且與此文相關(guān)性較小，因此不再贅述，研究人員在上世紀(jì)90年代初期著手努力研發(fā)相關(guān)酶的抑制劑來靶向RAS突變疾病的治療。其中最值得一提的是2007年Lee等人[5]在牛樟芝中萃取出的一種天然小分子化合物—安卓奎諾爾(商品名：安卓健)，現(xiàn)已全球范圍內(nèi)上市，其適應(yīng)癥包括非小細(xì)胞肺癌、肝細(xì)胞癌、乳腺癌等多種RAS突變導(dǎo)致的癌癥。另一個(gè)值得一提的是 Concordia公司研發(fā)的一款用于胰腺癌的小分子酶抑制劑（Salirasib）現(xiàn)在處于II期臨床實(shí)驗(yàn)階段。
△圖3、RAS蛋白生物學(xué)活性的酶催化作用機(jī)制許多抑制RAS突變的藥物在殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)對(duì)正常細(xì)胞造成不可逆的毒副作用。這種毒副作用限制了其在臨床上的應(yīng)用。正常細(xì)胞要變?yōu)榛蚪M不穩(wěn)定、無限增殖和抗凋亡等十大標(biāo)志的腫瘤細(xì)胞，在變化的過程需要許多表觀或遺傳學(xué)的改變以及微環(huán)境的變化[6]。細(xì)胞的這些表觀遺傳學(xué)的改變主要由于特定基因的變化，而這些特定的基因就可以作為腫瘤特異性治療的理想靶點(diǎn)。然而。單一特異性基因抑制不會(huì)對(duì)癌細(xì)胞造成死亡，需要篩選能夠協(xié)同作用的另一個(gè)基因，兩個(gè)基因同時(shí)被抑制才能特異性的殺死癌細(xì)胞而不損傷正常細(xì)胞，這就是合成致死或協(xié)同致死的基本原理。首款上市利用協(xié)同致死抗癌的藥物于2014年12月FDA批準(zhǔn)的，其原理是PARP抑制劑與BRCA1/2突變之間存在合成致死作用。部分RAS突變基因的協(xié)同致死基因的篩選結(jié)果經(jīng)過多年的努力及技術(shù)的革新，雖然科學(xué)家門篩選出的一系列的基因、酶類和化合物[7]，也不斷有新的靶點(diǎn)和協(xié)同致死“藥物”被發(fā)現(xiàn)，但進(jìn)入臨床仍需要大量的更加深入研究去驗(yàn)證。
盡管效應(yīng)抑制似乎是目前最有前途的RAS靶向策略，但仍存在相當(dāng)大的挑戰(zhàn)。首先，一種效應(yīng)通路的抑制都存在復(fù)雜的代償機(jī)制，需要多點(diǎn)抑制。其次，多個(gè)效應(yīng)分子具有驅(qū)動(dòng)作用，需要同時(shí)抑制多個(gè)通路。然而，正如前文中所述的那樣，同時(shí)多點(diǎn)或抑制多個(gè)通路可能打破正常細(xì)胞的生理狀態(tài)，引起機(jī)體毒性。多種“抑制劑”連用或合用將是其在成藥前首要考慮的問題。 治療RAS突變之路困難重重，但三十多年來一直是腫瘤學(xué)和治療領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，未來將會(huì)有更多的創(chuàng)新性“藥物”和治療手段不斷被開發(fā)出來，相信經(jīng)過不懈努力，RAS這個(gè)“無人高地”必將被攻陷。
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