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▲10月24日至25日，醫(yī)麥客將在上海舉辦第二屆生物創(chuàng)新藥臨床前研究與臨床申報(bào)峰會(huì)，本屆會(huì)議我們邀請(qǐng)到中檢院2020新版藥典專家、干細(xì)胞評(píng)審專家、上海CDE生物部專家、國(guó)家級(jí)藥效與毒理評(píng)價(jià)專家、世界級(jí)干細(xì)胞專家、創(chuàng)新藥代表企業(yè)等數(shù)十位權(quán)威意見領(lǐng)袖，歡迎正在做新藥研發(fā)的企業(yè)與同行來(lái)現(xiàn)場(chǎng)與專家一起交流，點(diǎn)擊上圖查看詳細(xì)日程。 點(diǎn)擊閱讀原文，搶先報(bào)名！
本文由醫(yī)麥客原創(chuàng)，歡迎分享，轉(zhuǎn)載須授權(quán) 2019年9月16日/醫(yī)麥客 eMedClub/--CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為當(dāng)前最熱門的基因編輯工具，可以介導(dǎo)多功能和高精度的基因組修飾，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤、遺傳性疾病和感染性疾病等多種重大疾病的治療。CRISPR/Cas9在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮基因編輯作用的形式分別是Cas9蛋白和gRNA, 而Cas9進(jìn)入細(xì)胞的形式可以有3種: DNA, RNA或蛋白; gRNA進(jìn)入細(xì)胞的形式有2種: DNA或RNA。然而，由于缺乏合適的遞送系統(tǒng)，限制了CRISPR/Cas9技術(shù)在臨床上的應(yīng)用。目前基于CRISPR/Cas9的治療技術(shù)主要是通過(guò)靶向遞送來(lái)實(shí)現(xiàn)的，CRISPR/Cas9系統(tǒng)的遞送方式主要包括：物理方法、病毒載體和非病毒載體。其中物理遞送方法比較常用的是電穿孔法，難以在體內(nèi)使用；病毒載體是目前使用最廣泛的一種方法，但其存在著潛在的安全性和有效性問(wèn)題，例如對(duì)宿主細(xì)胞可能產(chǎn)生致癌、致突變的風(fēng)險(xiǎn)，另外病毒載體負(fù)載能力有限(比如腺相關(guān)病毒只能負(fù)載不大于4.7 kb的DNA序列)。因此，目前許多研究聚焦在非病毒載體上，主要包括聚合物、脂質(zhì)體、納米材料，以及新興的外泌體等。如何安全有效地將CRISPR/Cas9系統(tǒng)遞送至生物體內(nèi)并發(fā)揮其基因編輯功能，仍面臨著許多機(jī)遇和挑戰(zhàn)。
CRISPR/Cas9系統(tǒng)的遞送形式及非病毒載體 使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行基因組編輯通常有三種策略，第一種也是最簡(jiǎn)便的方法是將CRISPR/Cas9系統(tǒng)所需的Cas9蛋白和sgRNA編碼進(jìn)同一個(gè)質(zhì)粒DNA (plasmid DNA, pDNA)載體中, 從而避免不同組分的多次轉(zhuǎn)染.。第二種策略是遞送Cas9蛋白的信使RNA (messager RNA, mRNA)和sgRNA。第三種策略是直接使用Cas9蛋白和sgRNA形成核糖核蛋白(Ribo-nucleoprotein, RNP)進(jìn)行基因組編輯。每種方法都有其優(yōu)缺點(diǎn), 并面臨著獨(dú)特的挑戰(zhàn)。▲ CRISPR/Cas9系統(tǒng)的遞送形式（圖片來(lái)源于參考來(lái)源5）遞送pDNA基于pDNA（將CRISPR/Cas9系統(tǒng)所需的Cas9蛋白和sgRNA編碼進(jìn)同一個(gè)質(zhì)粒DNA (plasmid DNA, pDNA)載體中）的CRISPR/Cas9的系統(tǒng), 由于操作簡(jiǎn)單且成本低而成為極具吸引人的一種方法，然而, 編碼后pDNA的尺寸過(guò)大會(huì)顯著增加CRISPR/Cas9系統(tǒng)遞送和表達(dá)的難度；pDNA進(jìn)入細(xì)胞核后的轉(zhuǎn)錄過(guò)程會(huì)降低基因編輯的效率并且還會(huì)導(dǎo)致治療過(guò)程的延遲；此外, 基于pDNA的表達(dá)通常會(huì)導(dǎo)致Cas9蛋白長(zhǎng)時(shí)間存在于細(xì)胞中, 這可能會(huì)導(dǎo)致更高的脫靶效應(yīng)和強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答。 陽(yáng)離子聚合物通過(guò)靜電作用與pDNA進(jìn)行絡(luò)合形成復(fù)合物而保護(hù)pDNA免于核酸酶降解。其次, 通過(guò)對(duì)陽(yáng)離子聚合物與pDNA的比例進(jìn)行精細(xì)調(diào)控, 實(shí)現(xiàn)了對(duì)負(fù)載pDNA的納米粒子的粒徑及表面電荷進(jìn)行精確控制, 從而使細(xì)胞對(duì)pDNA攝取的最大化, 并促進(jìn)Cas9蛋白及sgRNA的表達(dá)。然而Cas9蛋白的大分子量使得編碼CRISPR/Cas9系統(tǒng)的pDNA尺寸較大, 所以很難對(duì)各方面同時(shí)進(jìn)行優(yōu)化。高分子聚合物由短鏈重復(fù)單元聚合而形成, 由于重復(fù)單元的結(jié)構(gòu)高度可控, 可以根據(jù)所載物質(zhì)的響應(yīng)性需求進(jìn)行精確的設(shè)計(jì), 這種在結(jié)構(gòu)上無(wú)可比擬的多樣性和功能上的全面性, 賦予了高分子聚合物在遞送pDNA時(shí)的無(wú)限可能。聚乙烯亞胺(polyethyleneimine, PEI)、殼聚糖和聚(L-賴氨酸)是被研究最透徹也是目前應(yīng)用最廣泛的三種陽(yáng)離子聚合物。遞送Cas9蛋白的mRNA和sgRNACas9蛋白的mRNA可以比較容易地通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄獲得，使用Cas9蛋白的mRNA的優(yōu)勢(shì)在于可以較快速地啟動(dòng)基因編輯, 因?yàn)閙RNA不需要再進(jìn)入細(xì)胞核進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，也因此能夠?qū)RNA的劑量進(jìn)行精確控制, 且能顯著性降低CRISPR/Cas9系統(tǒng)的脫靶效應(yīng)。mRNA的穩(wěn)定性相對(duì)較差，為了實(shí)現(xiàn)對(duì)mRNA高效且精準(zhǔn)的遞送, 在載體的設(shè)計(jì)方面必須保護(hù)mRNA免受胞外核酸酶的降解。多種市售脂質(zhì)復(fù)合物已經(jīng)大量用于體外和體內(nèi)轉(zhuǎn)染，已有研究利用脂質(zhì)體作為載體遞送Cas9蛋白的mRNA, 在細(xì)胞水平上和小鼠體內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)哺乳動(dòng)物基因組的精確編輯，但脂質(zhì)體較高的細(xì)胞毒性問(wèn)題是其優(yōu)化升級(jí)的主要方向。另外常規(guī)pDNA載體足以達(dá)到mRNA遞送的要求，近年來(lái)，聚合物類載體, 如殼聚糖、PEI及聚(β-氨基酯)均已從pDNA的載體適配到mRNA的遞送體系上。直接遞送Cas9蛋白和sgRNA對(duì)于CRISPR/Cas9系統(tǒng)來(lái)說(shuō), 最高效的方式就是跳過(guò)pDNA或mRNA在細(xì)胞內(nèi)對(duì)Cas9蛋白及sgRNA的表達(dá), 而且對(duì)Cas9蛋白和sgRNA直接進(jìn)行遞送，可以最大程度地降低脫靶效應(yīng)。將Cas9蛋白直接進(jìn)行遞送并實(shí)現(xiàn)基因組的高效編輯必不可少的兩個(gè)條件分別是：載體協(xié)助Cas9蛋白成功實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)遞送以及高效的溶酶體逃逸。負(fù)載Cas9蛋白的納米遞送系統(tǒng)可協(xié)助Cas9蛋白進(jìn)入目標(biāo)細(xì)胞, 在對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行切割后可立即通過(guò)內(nèi)源性蛋白酶進(jìn)行快速降解以實(shí)現(xiàn)更高的基因編輯效率和更低的脫靶效應(yīng)。通常, 蛋白質(zhì)主要有三種遞送方式：蛋白質(zhì)與載體的直接綴合、蛋白質(zhì)與載體基于電荷或親疏水作用的物理吸附以及基于乳液分散所形成的蛋白質(zhì)納米膠囊。常用于遞送蛋白質(zhì)的納米載體包括膠體納米顆粒(如脂質(zhì)體和固體脂質(zhì)納米顆粒)、聚合物納米材料(如聚合物膜、納米膠囊以及膠束)、無(wú)機(jī)納米載體(如碳納米管、量子點(diǎn)、介孔二氧化硅、磁性納米顆粒、金納米顆粒、金屬有機(jī)框架、黑磷納米片)等。目前大部分基于Cas9蛋白的遞送體系都是以RNP的形式進(jìn)行遞送，現(xiàn)有的蛋白質(zhì)遞送平臺(tái)將為Cas9蛋白和RNP遞送提供巨大潛力。▲ CRISPR/Cas9的非病毒遞送載體（圖片來(lái)源于參考來(lái)源5）
近期研究進(jìn)展 宮紹琴(Shaoqin Gong)教授團(tuán)隊(duì)美國(guó)威斯康辛大學(xué)麥迪遜分校的宮紹琴教授團(tuán)隊(duì)致力于設(shè)計(jì)和建造用于靶向治療的納米級(jí)遞送系統(tǒng)，提供各種有效載荷，包括小分子藥物、蛋白質(zhì)、DNA、RNA和基于CRISPR的基因組編輯劑等。他們開發(fā)的可定制的高效納米平臺(tái)，為在體和離體應(yīng)用提供Cas9 RNP復(fù)合物。該研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)原位聚合合成，設(shè)計(jì)了一種直徑約25nm的納米膠囊(NC)，其外殼涂有薄的谷胱甘肽(GSH) - 可切割的共價(jià)交聯(lián)聚合物，用來(lái)包裹Cas9核酸酶和sgRNA之間的預(yù)裝配核糖核蛋白(RNP)復(fù)合物。這種可定制合成納米膠囊，實(shí)現(xiàn)了CRISPR組分的受控化學(xué)計(jì)量，并避免體內(nèi)潛在的安全性問(wèn)題。相關(guān)研究結(jié)果于2019年9月9日發(fā)表在Nature Nanotechnology上。團(tuán)隊(duì)下一步將優(yōu)化正在研究的納米膠囊，以便有效地在大腦和眼睛進(jìn)行編輯。 Nature子刊: 華人科學(xué)家開發(fā)遞送CRISPR-Cas9的納米膠囊，有望實(shí)現(xiàn)更安全可控的治療丨醫(yī)麥猛爆料
 美國(guó)波士頓兒童醫(yī)院
2019年8月26日，美國(guó)波士頓兒童醫(yī)院(Boston Children’s Hospital)的研究人員首次成功使用靶向的CRISPR基因編輯技術(shù)來(lái)阻止TNBC（三陰性乳腺癌，所有乳腺癌中死亡率最高的）腫瘤在體內(nèi)的生長(zhǎng)（通過(guò)注射到活的腫瘤小鼠體內(nèi)）。相關(guān)研究發(fā)表在美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(PNAS)上，主要報(bào)道了一種用于腫瘤基因編輯的非陽(yáng)離子、可變形、靶向腫瘤的納米脂凝膠系統(tǒng)(tNLG)的合成和應(yīng)用。
該研究中，CRISPR系統(tǒng)被封裝在納米脂質(zhì)凝膠顆粒中，這種載體由無(wú)毒脂肪分子和水凝膠組成，無(wú)毒、具有良好的柔性和彈性，可與靶向細(xì)胞的細(xì)胞膜融合，并有效遞送攜帶的DNA序列。另外，凝膠表面偶聯(lián)了特定的抗體，可特異性識(shí)別TNBC細(xì)胞的靶點(diǎn)ICAM-1蛋白，從而將CRISPR系統(tǒng)引導(dǎo)至腫瘤部位，敲除乳腺癌促進(jìn)基因之一Lipocalin-2（LCN2），從而達(dá)到治療的目的。結(jié)果顯示，腫瘤細(xì)胞組織的基因敲除效率達(dá)到81%，腫瘤生長(zhǎng)速率降低了77%，與此同時(shí)，正常的細(xì)胞組織沒(méi)有受到明顯的影響。
Tufts University與中國(guó)科學(xué)院2019年6月19日，Tufts University與中國(guó)科學(xué)院(Chinese Academy of Sciences)合作的一項(xiàng)研究發(fā)表在《Advanced Materials》雜志上。該研究中描述了一種可生物降解的合成脂質(zhì)納米顆粒（BAMEA‐O16B），可導(dǎo)致CRISPR/Cas9基因編輯方法在肝臟中的傳遞機(jī)制得到顯著改善。這種脂質(zhì)納米顆粒封裝了編碼Cas9的信使RNA (mRNA)和sgRNA，由可生物再生的連接劑制成的合成脂質(zhì)形成內(nèi)容物的封裝墻，在進(jìn)入細(xì)胞后，無(wú)論是在體外還是在體內(nèi)，連接物被破壞、納米顆粒解體、內(nèi)容物釋放，隨后細(xì)胞的蛋白質(zhì)生成機(jī)制開始通過(guò)mRNA模板生成Cas9活性酶，完成基因編輯工具。BAMEA‐O16B最快可在24小時(shí)后便釋放mRNA以響應(yīng)細(xì)胞內(nèi)還原環(huán)境進(jìn)行基因組編輯，并以相當(dāng)高的效率精確地改變細(xì)胞的遺傳密碼。而關(guān)于脂質(zhì)納米粒子遞送技術(shù)，不得不提的就是Intellia Therapeutics和諾華。2018年2月27日，Intellia Therapeutics宣布發(fā)表了名為《CRISPR / Cas9脂質(zhì)納米粒子的單一管理實(shí)現(xiàn)了強(qiáng)大和持久的體內(nèi)基因組編輯》的臨床前數(shù)據(jù)的細(xì)胞報(bào)告，展示了在使用脂質(zhì)納米粒子（LNP）遞送技術(shù)后進(jìn)行CRISPR / Cas9基因編輯所得到的安全有效的數(shù)據(jù)結(jié)果。2018年12月，Intellia公司與諾華合作，把諾華專有的脂質(zhì)納米粒子遞送技術(shù)（LNP）擴(kuò)展到所有在研項(xiàng)目中，用于遞送CRISPR/Cas9組分。目前，該公司推進(jìn)最快的在體基因編輯療法針對(duì)致耐受性器官(肝臟)的疾病——轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白淀粉樣變性(ATTR)，預(yù)計(jì)將于2019年底提交IND申請(qǐng)。新型納米顆粒以更高的效率將CRISPR基因編輯工具送入細(xì)胞丨醫(yī)麥猛爆料 韓國(guó)東國(guó)大學(xué)（Dongguk University ） 2019年3月11日，Nature Neuroscience 雜志發(fā)表了一項(xiàng)關(guān)于阿爾茲海默病的研究進(jìn)展，為治愈阿爾茲海默病帶來(lái)新的曙光。該研究的通訊作者為韓國(guó)東國(guó)大學(xué)（Dongguk University ）的Jongpil Kim。
阿爾茨海默?。ˋD），俗稱老年癡呆癥，是最常見的神經(jīng)退行性疾病，β淀粉樣蛋白（Aβ）積累是其特征之一。由于β-分泌酶1（Bace1）是產(chǎn)生β淀粉樣蛋白（Aβ）所必需的，因此靶向Bace1是阿爾茨海默病治療的潛在治療策略。然而實(shí)現(xiàn)在不分裂的神經(jīng)元細(xì)胞中的體內(nèi)基因靶向編輯，仍然是基于CRISPR/Cas9的基因編輯治療的一個(gè)巨大挑戰(zhàn)。 該研究通過(guò)一種CRISPR/Cas9-納米復(fù)合物，成功在體內(nèi)神經(jīng)元中編輯了Bace1基因，減輕了阿爾茨海默病小鼠模型的β淀粉樣蛋白（Aβ）相關(guān)病理和認(rèn)知缺陷且未發(fā)現(xiàn)脫靶效應(yīng)。使用非病毒載體的Cas9-納米復(fù)合物進(jìn)行體內(nèi)基因編輯的研究拓寬了CRISPR/Cas9系統(tǒng)在神經(jīng)退行性疾病中的潛在應(yīng)用。
進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)基于非病毒載體的CRISPR/Cas9系統(tǒng)的可控性 2019年4月3日，南京大學(xué)現(xiàn)代工程與應(yīng)用科學(xué)學(xué)院相關(guān)團(tuán)隊(duì)在Science Advances發(fā)表文章'Near-infrared upconversion–activated CRISPR-Cas9 system: A remote-controlled gene editing platform'，該團(tuán)隊(duì)利用光敏分子、上轉(zhuǎn)換納米顆粒（UCNPs）和CRISPR-Cas9，設(shè)計(jì)出了一種可以遠(yuǎn)程操縱的基因編輯技術(shù)。文章通訊作者：宋玉君教授（南京大學(xué)）、林友輝副教授（廈門大學(xué)）、王玉珍副研究員（南京工業(yè)大學(xué)）。近年來(lái)，一些非病毒載體被開發(fā)并被用于CRISPR-Cas9體系中，但基于非病毒載體實(shí)現(xiàn)可控的基因編輯的研究鮮有報(bào)道。宋玉君教授課題組致力于開發(fā)高效的、基于非病毒載體的CRISPR-Cas9系統(tǒng)，希望能在空間和時(shí)間上實(shí)現(xiàn)對(duì)體內(nèi)基因組精確可控的編輯，為此他們?cè)O(shè)計(jì)了一種基于上轉(zhuǎn)換納米粒子（UCNPs）的CRISPR/Cas9遞送系統(tǒng)，用于癌癥治療。具體來(lái)說(shuō)，該系統(tǒng)利用光敏分子將CRISPR-Cas9體系共價(jià)“鎖”在UCNPs上，并且用一層高分子材料PEI包被，該復(fù)合納米粒子被稱為“UCNPs-Cas9@PEI”，它可以通過(guò)胞吞作用途徑被細(xì)胞有效內(nèi)吞。然后在近紅外光照射下，UCNPs可以吸收近紅外光將其轉(zhuǎn)換成高能紫外光，發(fā)射出的紫外光解開Cas9蛋白和UCNPs之間的“鎖”，從而實(shí)現(xiàn)CRISPR-Cas9的按需可控釋放，從而進(jìn)入細(xì)胞核實(shí)現(xiàn)基因剪切。該技術(shù)不僅可以控制CRISPR/Cas9的釋放時(shí)間，還由于紅外光的強(qiáng)組織穿透性，有望在深層組織中實(shí)現(xiàn)CRISPR-Cas9基因編輯的精確調(diào)控。
外泌體遞送CRISPR/Cas9系統(tǒng)的潛力 外泌體（EV）作為細(xì)胞間通訊的一種自然方式，具有生物相容性，在適當(dāng)?shù)臅r(shí)候具有免疫惰性，并且可以有效地到達(dá)目標(biāo)，越來(lái)越多的被作為小分子療法、蛋白質(zhì)、RNA、DNA和潛在的新CRISPR技術(shù)的遞送載體。例如，腫瘤來(lái)源的外泌體在體外通過(guò)電穿孔的方式包裝CRISPR / Cas9表達(dá)質(zhì)粒，用作CRISPR / Cas9系統(tǒng)的載體。此外，一種脂質(zhì)體雜交外泌體所得到的雜合納米粒子可以有效地將大的CRISPR / Cas9表達(dá)質(zhì)粒包封并遞送到靶細(xì)胞中。同樣，遞送質(zhì)粒存在非特異性編輯的風(fēng)險(xiǎn)，遞送Cas9蛋白 /gRNA復(fù)合物或更具安全性。2019年7月4日，來(lái)自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院魯鳳民、王杰課題組的研究人員發(fā)現(xiàn)，表達(dá)CRISPR/Cas9的細(xì)胞可以分泌攜帶功能性gRNA和Cas9蛋白的外泌體，這些外泌體可以向其他組織細(xì)胞輸送基因編輯活性。該研究證明了內(nèi)源外泌體作為功能性gRNA和Cas9蛋白的安全有效遞送載體的潛力。外泌體的這一作用雖然可以避免病毒載體系統(tǒng)本身帶來(lái)的副作用，但由于外泌體的廣泛傳遞性也為這一系統(tǒng)的應(yīng)用帶來(lái)了新的風(fēng)險(xiǎn)。這項(xiàng)研究發(fā)表于Small雜志上。2018年香港城市大學(xué)Jiahai Shi教授和Minh Le教授等人發(fā)表在《Nature Communications》上的一篇名為“Efficient RNA drug delivery using red blood cell extracellular vesicles”的文章。描述并驗(yàn)證了一種新的策略，該策略可產(chǎn)生大量由RBC衍生的EV（RBCEV），并證明RBCEVs介導(dǎo)的RNA藥物傳遞在白血病和乳腺癌細(xì)胞中表現(xiàn)出高效的microRNA敲低和CRISPR Cas9基因編輯敲除功能，并且不產(chǎn)生任何細(xì)胞毒性。由于目前生產(chǎn)EV的細(xì)胞來(lái)源在水平基因轉(zhuǎn)移的有效性和安全性方面受到限制，這一發(fā)現(xiàn)或?qū)⒔鉀Q外泌體作為基因治療遞送系統(tǒng)的細(xì)胞來(lái)源問(wèn)題。新銳生物公司Carmine Therapeutics基于這項(xiàng)紅細(xì)胞外泌體遞送技術(shù)的REGENT平臺(tái)是一個(gè)專有的RBCEV分離、工程化和制造平臺(tái)，正在血液學(xué)、腫瘤學(xué)和免疫學(xué)領(lǐng)域開發(fā)下一代基因療法。
應(yīng)對(duì)外泌體作為基因治療遞送系統(tǒng)的細(xì)胞來(lái)源問(wèn)題，這家公司的變革性技術(shù)值得期待丨醫(yī)麥黑科技
結(jié) 語(yǔ) 使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行基因編輯所面臨的主要挑戰(zhàn)是將該系統(tǒng)有效地遞送至目的細(xì)胞中。非病毒載體在CRISPR/Cas9系統(tǒng)的體內(nèi)應(yīng)用中將起到關(guān)鍵作用。在今年8月公布的國(guó)家自然科學(xué)基金申請(qǐng)項(xiàng)目評(píng)審結(jié)果中也不乏CRISPR/Cas9系統(tǒng)遞送系統(tǒng)的研究：負(fù)責(zé)人：Anna Czarna 申請(qǐng)單位：華南理工大學(xué) 研究類型：面上項(xiàng)目 項(xiàng)目批準(zhǔn)號(hào)：81971723 批準(zhǔn)年度：2019負(fù)責(zé)人：于博 申請(qǐng)單位：南方醫(yī)科大學(xué) 研究類型：面上項(xiàng)目 項(xiàng)目批準(zhǔn)號(hào)：81974323 批準(zhǔn)年度：2019與編碼Cas9蛋白的pDNA或mRNA不同, 對(duì)Cas9蛋白/sgRNA直接進(jìn)行遞送可以避免細(xì)胞核對(duì)CRISPR/Cas9系統(tǒng)翻譯過(guò)程中的非預(yù)期整合、最小化脫靶效應(yīng)以實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)基因的高效編輯。然而負(fù)載Cas9蛋白的納米粒子在保持蛋白生物活性的同時(shí)很難保護(hù)其免受血液中胰酶降解和單核系統(tǒng)清除。與pDNA或mRNA相比, 可供選擇的蛋白質(zhì)載體少之又少, 因此發(fā)展能夠克服Cas9蛋白所固有問(wèn)題的非病毒載體將極可能把CRISPR/Cas9技術(shù)的應(yīng)用推向另一高度。
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