在許多實(shí)體瘤和血液腫瘤中都發(fā)現(xiàn)I型PRMTs的表達(dá)水平上調(diào)，而在一些腫瘤類型中，這種過表達(dá)與患者預(yù)后有關(guān)。此外，有實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，I型PRMTs可以通過組蛋白和非組蛋白底物上精氨酸殘基的甲基化，促進(jìn)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、增殖、侵襲和存活。總的來說，消除關(guān)鍵底物上的ADMA修飾會(huì)降低癌細(xì)胞的增殖能力，說明抑制I型PRMTs可能為多種人類癌癥的治療干預(yù)提供有效的策略。

研究人員從其發(fā)展的Epizyme’s protein methyltransferase biased compound collection庫中篩選發(fā)現(xiàn)了I型PRMT抑制劑（這個(gè)庫是一個(gè)專門用于設(shè)計(jì)發(fā)現(xiàn)賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶和精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑的集中庫）。經(jīng)過一系列以平衡細(xì)胞效力和藥代動(dòng)力學(xué)(PK)特性的優(yōu)化目標(biāo)的化合物優(yōu)化與改造，最終發(fā)現(xiàn)GSK3368715及其類似物GSK3368712確認(rèn)為PRMT1的有效抑制劑。

詳細(xì)的生化特性表明，GSK3368715和GSK3368712不僅對(duì)于PRMT1，也可以對(duì)I型PRMT家族中的3、4、6、8等幾個(gè)亞型具有效果，Ki*app值范圍為1.5 ~ 81 nM)，且對(duì)II型和III型PRMTs無抑制作用。進(jìn)一步酶動(dòng)力學(xué)的研究表明GSK3368715是PRMT1的一種SAM非競(jìng)爭(zhēng)性和多肽底物混合型競(jìng)爭(zhēng)性的抑制劑。為了更好的確認(rèn)其作用方式，研究人員解析了PRMT1與GSK3368715的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)GSK3368715是直接結(jié)合于SAM口袋附近的肽位點(diǎn)。

在明確了體外活性后，研究人員以ADMA、SDMA和MMA為分子標(biāo)記物，對(duì)GSK3368715進(jìn)行了腫瘤細(xì)胞的治療效果評(píng)價(jià)。在治療窗口中，24h內(nèi)細(xì)胞總ADMA水平明顯下降，最大降幅為72小時(shí)。穩(wěn)固的MMA和SDMA誘導(dǎo)均在24 h內(nèi)出現(xiàn)，48 h后均達(dá)到峰值。與MMA誘導(dǎo)相關(guān)的劑量反應(yīng)表明，細(xì)胞對(duì)GSK3368715的半最大有效濃度（EC₅₀）為13.6±0.3 nM。總的來說，精氨酸甲基化的這些時(shí)間和劑量依賴的總體變化證明了這一點(diǎn)，GSK3368715是一種有效的細(xì)胞活性的I型PRMT抑制劑。

進(jìn)一步，研究人員一共使用了12種腫瘤類型的249個(gè)腫瘤細(xì)胞系進(jìn)行測(cè)試，進(jìn)行了為期6天的增殖試驗(yàn)來確定I型PRMT抑制劑是否對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和生存能力有效。與DMSO處理的細(xì)胞相比，評(píng)估顯示GSK3368715對(duì)大多數(shù)細(xì)胞系的生長(zhǎng)抑制作用都≥50%，所以用其生長(zhǎng)半最大抑制濃度(gIC₅₀)來量化。引入生長(zhǎng)死亡指數(shù)[GDI]來評(píng)估細(xì)胞死亡或細(xì)胞毒性，將治療后剩余的細(xì)胞數(shù)量相對(duì)于添加化合物時(shí)的細(xì)胞數(shù)量和DMSO第6天的對(duì)照進(jìn)行量化，負(fù)的GDI值表明細(xì)胞毒性反應(yīng)。在淋巴瘤和AML細(xì)胞系中效果最為明顯，分別在56%和50%的檢測(cè)細(xì)胞系中觀察到細(xì)胞毒性。雖然大多數(shù)實(shí)體腫瘤細(xì)胞系對(duì)GSK3368715只具有細(xì)胞抑制應(yīng)答，但在這些細(xì)胞系的也有一個(gè)亞群中細(xì)胞毒效應(yīng)明顯，包括17%的非小細(xì)胞肺癌和13%的胰腺癌。

利用病人樣本派生而來的DLBCL模型進(jìn)行克隆形成實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)I型PRMT抑制在這些患者樣本原代細(xì)胞中表現(xiàn)出抗增殖作用，6/10患者樣本在1.25 μM時(shí)生長(zhǎng)抑制率超過50%，所有樣本在5 μM時(shí)生長(zhǎng)抑制率達(dá)到80%。GSK 3368715和GSK3368712的藥代動(dòng)力學(xué)分析表明，這兩種化合物均具有適宜的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，可用于口服和體內(nèi)抗腫瘤活性的評(píng)價(jià)，在小鼠上耐受性良好。Toledo DLBCL細(xì)胞株體外對(duì)GSK3368715具有細(xì)胞毒性反應(yīng)，gIC₅₀為59 nM。每日給藥一次GSK3368715可誘導(dǎo)劑量依賴性抑制Toledo腫瘤生長(zhǎng)，并可使>75 mg/kg治療的小鼠腫瘤消退。BxPC3胰腺腺癌細(xì)胞系的gIC₅₀為2,100 nM，在GSK3368715濃度超過10μm時(shí)具有細(xì)胞毒性，每日單次給藥I型PRMTi對(duì)所有測(cè)試劑量的BxPC3移植瘤生長(zhǎng)均有顯著影響，150-和300-mg/kg劑量組腫瘤生長(zhǎng)分別降低78%和97%。在透明細(xì)胞腎癌(ACHN)和三陰性乳腺癌(MDA-MB-468)異種移植瘤模型中，每日一次給藥150mg /kgGSK3368715的療效研究顯示，腫瘤生長(zhǎng)抑制率分別為98%和85%。在患者來源的胰腺腺癌異種移植模型中，I型PRMTi對(duì)腫瘤生長(zhǎng)有顯著影響，在300 mg/kg組中抑制了＞90%的腫瘤生長(zhǎng)。這些數(shù)據(jù)表明，GSK3368715具有跨實(shí)體瘤和血液腫瘤細(xì)胞株的有效抗增殖活性，可完全抑制腫瘤生長(zhǎng)或?qū)е麦w內(nèi)腫瘤模型的退化。

I型PRMT底物的識(shí)別

為了研究其作用的生物學(xué)機(jī)制，并檢測(cè)I型PRMT抑制精氨酸甲基化的效果，研究人員使用親和富集蛋白組學(xué)來鑒定ADMA、SDMA或MMA變化的蛋白。用特異性抗體富集I型PRMT抑制劑處理的細(xì)胞中的每種甲基化狀態(tài)的蛋白后，用質(zhì)譜法鑒定純化肽，并計(jì)算相對(duì)于DMSO處理細(xì)胞的富集倍數(shù)變化。在分析的DLBCL和胰腺癌細(xì)胞系中，I型PRMT抑制改變了445個(gè)特定蛋白的精氨酸甲基化標(biāo)記。一個(gè)已知的PRMT1底物，KHDRBS1，也在質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)集中發(fā)現(xiàn)，證實(shí)I型PRMTi抑制其精氨酸291的ADMA。在胰腺癌細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)精氨酸甲基化水平變化的的349種蛋白中，有100種是三個(gè)細(xì)胞系中都有變化。在Toledo和 OCI-Ly1 DLBCL細(xì)胞系中，一共發(fā)現(xiàn)276種蛋白精氨酸甲基化水平變化，其中有259種是兩株細(xì)胞內(nèi)都有變化。此外，有82種蛋白在這兩種組織中，其精氨酸甲基化水平都發(fā)生變化，這表明I型PRMTs調(diào)控一組核心的生物學(xué)過程這些蛋白的通路分析顯示，他們富集在mRNA加工和剪接過程中，包括mRNA帽結(jié)合復(fù)合體的幾個(gè)組分(包括EIF4G1和EIF4H)，以及核糖體亞單位。除了mRNA處理和剪接蛋白外，I型PRMTi還改變了MYC靶蛋白的精氨酸甲基化，而MYC通路也包含許多剪接和RNA結(jié)合蛋白，表明其通過多種機(jī)制影響剪接。

I型PRMT抑制改變剪接

親和富集蛋白組學(xué)鑒定的精氨酸甲基化變化的交集蛋白參與多種mRNA前處理步驟，包括已知的外顯子調(diào)控因子SFPQ, FUS, 和14種屬于異質(zhì)核糖核蛋白 (hnRNP)家族的蛋白。hnRNP蛋白精氨酸甲基化可以調(diào)控與其他因子的相互作用以及亞細(xì)胞定位，因此，I型PRMT抑制精氨酸甲基化的變化可能導(dǎo)致異常的外顯子使用。為了了解從ADMA到SDMA或MMA的轉(zhuǎn)變對(duì)RNA加工因子的功能結(jié)果，研究人員采用RNA-Seq的方法來研究I型PRMT抑制對(duì)整體剪接模式的影響。在一組用I型PRMTi治療的胰腺癌細(xì)胞系中采用轉(zhuǎn)錄剪接的多元分析的方法，定量RNA-seq中蛋白質(zhì)編碼RNA（poly(A)selected RNA）的差異剪接事件。所有被檢測(cè)的細(xì)胞系都發(fā)現(xiàn)了顯著的剪接變化，其中對(duì)GSK3368715生長(zhǎng)抑制最敏感的細(xì)胞系發(fā)生的剪接變化最多。外顯子跳過是所有四種細(xì)胞系中觀察到的最常見的改變類型，在抑制劑治療后傾向于排斥外顯子。外顯子跳過事件得到了RT-qPCR的驗(yàn)證。其中大多數(shù)事件對(duì)每個(gè)細(xì)胞系都是獨(dú)特的，只有194個(gè)事件對(duì)所有細(xì)胞系都是相同的。然而，化合物處理引起了基因剪接在細(xì)胞系之間的共同變化通路主要包括細(xì)胞周期和有絲分裂。這些數(shù)據(jù)表明，I型PRMT抑制導(dǎo)致細(xì)胞剪接的深刻變化，主要影響外顯子的使用。

聯(lián)合抑制I型PRMT和PRMT5的抗增殖作用

PRMT5是II型PRMT，催化細(xì)胞大部分的SDMA，已知與PRMT1共享底物。PRMT5在多種腫瘤類型中過表達(dá)，選擇性的PRMT5抑制劑最近進(jìn)入臨床試驗(yàn)。研究人員對(duì)一組細(xì)胞系進(jìn)行了GSK3368715和PRMT5抑制劑GSK3203591的聯(lián)合治療。在胰腺癌細(xì)胞系中檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合用藥可以增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制效應(yīng)，并且在低濃度時(shí)就可誘導(dǎo)細(xì)胞毒性反應(yīng)。使用Bliss模型計(jì)算協(xié)同作用評(píng)分后發(fā)現(xiàn)，I型PRMTi與GSK3203591聯(lián)合使用，在一定濃度范圍內(nèi)對(duì)胰腺癌和DLBCL細(xì)胞系的凈細(xì)胞生長(zhǎng)具有很強(qiáng)的協(xié)同作用。為了在體內(nèi)評(píng)價(jià)這種聯(lián)合用藥的療效和耐受性，將攜帶MiaPaca-2異種胰腺腺癌的小鼠與I型PRMTi (GSK3368715)或PRMT5抑制劑GSK3326595單獨(dú)用藥，或與另一種藥物的固定濃度聯(lián)合滴定。作為單一療法，最高劑量的I型PRMTi和PRMT5i對(duì)腫瘤生長(zhǎng)產(chǎn)生了顯著但不完全的影響。每天給藥一次200mg /kg的PRMT5抑制劑與每天給藥兩次100mg /kg的效果相當(dāng)。每一種藥物的低劑量對(duì)腫瘤生長(zhǎng)沒有顯著影響。在這兩項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中，在所有測(cè)試劑量下，聯(lián)合用藥均比單獨(dú)使用任何一種藥物顯著增強(qiáng)了對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用且對(duì)聯(lián)合用藥耐受性良好。

聯(lián)合抑制PRMT對(duì)精氨酸甲基化和整體剪接的影響

之前的研究表明，抑制PRMT5可以改變SDMA對(duì)剪接調(diào)控因子的作用，對(duì)細(xì)胞剪接產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。在聯(lián)合用藥處理的細(xì)胞中，SDMA水平降低，MMA的積累被抑制。相反，基礎(chǔ)ADMA和MMA狀態(tài)不受PRMT5單獨(dú)抑制的影響。這些數(shù)據(jù)表明，抑制I型PRMT活性產(chǎn)生的MMA和SDMA主要依賴于酶活性PRMT5。KHRDBS1的質(zhì)譜分析顯示，聯(lián)合使用I型PRMT和PRMT5抑制劑治療后，R291上的ADMA和SDMA受到抑制。利用質(zhì)譜進(jìn)一步研究了I型PRMTs和PRMT5聯(lián)合抑制對(duì)單個(gè)蛋白底物的影響。在單用I型PRMTi處理時(shí)， 34%和76%的肽段聯(lián)合用藥后，MMA或SDMA的誘導(dǎo)率分別降低了4倍。這些數(shù)據(jù)表明，聯(lián)合使用type I PRMTs和 PRMT5可以產(chǎn)生精氨酸甲基化的減少狀態(tài)，并可能表現(xiàn)為相對(duì)于單獨(dú)使用任何一種抑制劑，對(duì)I型PRMT底物功能的不同影響。

為了了解抑制劑聯(lián)合誘導(dǎo)的整體甲基化狀態(tài)降低的功能后果，使用了RNA-seq來比較單一藥物和聯(lián)合治療對(duì)Panc03.27細(xì)胞系RNA剪接的改變。這兩種單因子對(duì)所有類型的剪接都有顯著的影響，其中外顯子跳過的頻率最高。I型PRMTi(1,405)和PRMT5i(1,400)之間跳過的外顯子總數(shù)相似，這兩種化合物共誘導(dǎo)了260個(gè)外顯子。聯(lián)合用藥導(dǎo)致了3,730個(gè)外顯子跳過事件，其中822個(gè)(22%)和724個(gè)(19%)分別與I型PRMTi和PRMT5i共享，所有三種情況下共有219個(gè)(6%)。這些數(shù)據(jù)表明，抑制PRMT5通過減弱MMA和SDMA的積累，加劇了I型PRMT抑制選擇性剪接的效果。

MTAP基因缺陷是對(duì)I型PRMT抑制敏感性的預(yù)測(cè)指標(biāo)

最近的研究發(fā)現(xiàn)MTAP缺失導(dǎo)致其代謝物MTA水平升高的機(jī)制，MTA此前被認(rèn)為是一種選擇性的、強(qiáng)效的PRMT5活性抑制劑，可導(dǎo)致細(xì)胞SDMA水平降低?？紤]到I型PRMTi與外源性PRMT5抑制劑對(duì)癌細(xì)胞增殖的協(xié)同作用，MTAP缺失可能為實(shí)現(xiàn)GSK3368715與PRMT5抑制的癌細(xì)胞內(nèi)在結(jié)合提供了一種可能。通過DNA拷貝數(shù)和mRNA或蛋白表達(dá)水平測(cè)定MTAP狀態(tài)的212株細(xì)胞系中，有56株MTAP缺失。GSK3368715在MTAP缺陷淋巴瘤、黑色素瘤和胰腺癌細(xì)胞系中的gIC50中值比野生型(WT)細(xì)胞系低6倍。外源MTA的加入使I型PRMTi的活性提高了10倍，在MTAP缺乏的細(xì)胞系中有更明顯效果。

為了明確評(píng)估MTAP與I型PRMT抑制之間的關(guān)系，研究人員利用CRISPR技術(shù)，從MTAP WT胰腺細(xì)胞系Panc03.27中構(gòu)建MTAP敲除株，該細(xì)胞系對(duì)I型PRMTi不敏感（gIC₅₀=12 μM)。MTAP敲除后，細(xì)胞內(nèi)MTA水平升高，SDMA相對(duì)于對(duì)照組下降。RNA-Seq的結(jié)果表明I型PRMTi在MTAP^KO/KO細(xì)胞系中誘導(dǎo)2,486個(gè)外顯子跳過事件，而在親本W(wǎng)T細(xì)胞系中誘導(dǎo)1,405個(gè)外顯子跳過事件，加劇了其mRNA的剪接。MTAP缺陷導(dǎo)致I型PRMTi在培養(yǎng)6天和10天的gIC₅₀分別減少7倍和12倍。此外，I型PRMTi在培養(yǎng)10天后誘導(dǎo)細(xì)胞毒性反應(yīng)，而親本細(xì)胞系和對(duì)照克隆只有細(xì)胞增殖抑制效果。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，通過MTAP缺陷部分抑制PRMT5活性可以揭示癌細(xì)胞對(duì)I型PRMT抑制的敏感性增強(qiáng)。

該研究闡述了I型PRMT抑制劑GSK3368715的發(fā)現(xiàn)，其通過影響細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)精氨酸甲基化水平發(fā)揮抗腫瘤作用，與PRMT5抑制劑GSK3203591的聯(lián)合使用加強(qiáng)了抗腫瘤的效果，MTAP的缺陷可以導(dǎo)致PRMT5的內(nèi)源性抑制劑MTA的積累，從而為I型PRMTi的病人選擇提供了方向。