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使用工程核酸酶的基因組編輯技術(shù)，比如鋅指核酸酶（ZFN）、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應物核酸酶（TALEN）和CRISPR系統(tǒng)中的Cas蛋白已被用于操縱許多有機體的基因組。最近，科學家們已將胞苷脫氨酶或腺苷脫氨酶與CRISPR-Cas9融合在一起，構(gòu)建出可編程的DNA堿基編輯器，從而為校正致病性突變提供新的機會。除了對DNA進行編輯之外，ADAR腺苷脫氨酶也被用于對RNA進行精確編輯：將腺苷（A）轉(zhuǎn)換為肌苷（I），即A→I轉(zhuǎn)換。三種類型的ADAR蛋白已在哺乳動物中鑒定出：ADAR1（異構(gòu)體p110和p150）、ADAR2和ADAR3，它們的底物都是雙鏈RNA（dsRNA）。在翻譯期間，肌苷被認為在模擬鳥苷（G）。

圖片來自Thomas Splettstoesser (Wikipedia, CC BY-SA 4.0

為了實現(xiàn)靶向RNA編輯，ADAR蛋白或者它的催化結(jié)構(gòu)域與一種λN肽、一種SNAP標簽或一種Cas蛋白（dCas13b）融合在一起，而且向?qū)NA（gRNA）經(jīng)設(shè)計后將這種融合的ADAR蛋白招募到特定位點上。此外，人們還報道，過量表達的ADAR1或ADAR2蛋白與帶有R/G基序的gRNA一起也能夠?qū)崿F(xiàn)靶向RNA編輯。

在哺乳動物系統(tǒng)中，所有這些報道的核酸編輯方法都依賴于兩種組分---一種酶和gRNA---的異位表達。盡管這些雙組分核酸編輯系統(tǒng)在大多數(shù)研究中高效地發(fā)揮作用，但是一些遺傳障礙限制了它們的廣泛應用，特別是在治療方面。這是因為體內(nèi)最有效的基因治療遞送方法是通過病毒載體實現(xiàn)的，而且高度理想的腺相關(guān)病毒（AAV）載體遞送的貨物（指的是編碼這兩種組分的DNA）大小是有限的，大約為4500個堿基，這就使得利用病毒載體容納這兩種組分充滿挑戰(zhàn)。科學家們最近已報道，ADAR1的過度表達因?qū)NA進行異常的高度編輯而在多發(fā)性骨髓瘤中具有致癌性，并可產(chǎn)生大量的全局性的脫靶編輯。蛋白或它們的非人類來源的結(jié)構(gòu)域的異位表達也存在著引發(fā)免疫原性的潛在風險。再者，預先存在的適應性免疫和p53介導的DNA損傷反應可能會破壞諸如Cas9之類的治療性蛋白的功效。

RNA編輯的內(nèi)在作用機制可通過將預組裝的靶轉(zhuǎn)錄物---RNA雙鏈體---注射到非洲爪蟾的胚胎中加以實現(xiàn)。2019年1月，Stafforst及其同事們報道了一種稱為RESTORE的RNA編輯方法，它的作用機制是使用經(jīng)過復雜化學修飾的化學合成反義寡核苷酸來招募內(nèi)源性的ADAR。

如今，在一項新的研究中，中國北京大學魏文勝（Wensheng Wei）課題組描述了一種使用內(nèi)源性ADAR進行RNA編輯的替代方法。他們證實表達招募ADAR的RNA（ADAR-recruiting RNA, arRNA），能夠?qū)崿F(xiàn)對內(nèi)源性RNA進行高效而又精確的編輯，并且成功地校正致病性突變。相關(guān)研究結(jié)果于2019年7月15日在線發(fā)表在Nature Biotechnology期刊上，論文標題為“Programmable RNA editing by recruiting endogenous ADAR using engineered RNAs”。

魏文勝課題組將這種方法稱為LEAPER（leveraging endogenous ADAR for programmable editing of RNA, 利用內(nèi)源性ADAR對RNA進行可編程編輯）。具體而言，LEAPER利用經(jīng)過改造的arRNA招募天然的ADAR1或ADAR2酶，從而將特定的腺苷轉(zhuǎn)變?yōu)榧≤铡?/p>

他們發(fā)現(xiàn)由質(zhì)粒或病毒載體或者作為合成寡核苷酸遞送的arRNA都可實現(xiàn)較高的編輯效率，最高可達80％。LEAPER是高度特異性的，具有極低的全局性脫靶編輯率，而且在靶區(qū)域中對除腺苷之外的堿基進行有限的編輯。

此外，魏文勝課題組發(fā)現(xiàn)LEAPER在包括多種人原代細胞在內(nèi)的很多細胞類型中具有活性，并且能夠在源自赫爾勒綜合征（Hurler syndrome）患者的原代成纖維細胞中恢復α-L-艾杜糖醛酸酶（α-L-iduronidase）的催化活性，而不會引起先天性免疫反應。

利用內(nèi)源性ADAR1蛋白實現(xiàn)靶向RNA編輯，圖片來自Nature Biotechnology, Pu

由此可見，魏文勝課題組發(fā)現(xiàn)具有足夠長度的線性arRNA的表達可引導內(nèi)源性ADAR蛋白在靶轉(zhuǎn)錄物上進行堿基編輯：將腺苷轉(zhuǎn)化為肌苷。相比于現(xiàn)有的編輯方法，LEAPER有幾個優(yōu)點。arRNA分子較小的尺寸讓人想起RNA干擾（RNAi），在RNAi中，小的雙鏈RNA分子誘導一種實現(xiàn)RNA靶向降解的天然機制，再者，這種較小的尺寸使得能夠通過各種病毒載體和非病毒載體加以遞送。不同于RNAi的是，LEAPER催化精確的A→I轉(zhuǎn)換，而不會切割或降解靶轉(zhuǎn)錄物。雖然arRNA的長度要比RNAi長，但是arRNA既不誘導細胞水平上的免疫刺激作用，也不影響內(nèi)源性ADAR蛋白的功能，這就使得它成為一種靶向RNA的安全策略。相反之下，人們已報道ADAR蛋白或它們的催化結(jié)構(gòu)域的異位表達誘導了大量的全局性的脫靶編輯，并且可能誘發(fā)癌癥。類似地，據(jù)報道，由于效應蛋白的表達，DNA堿基編輯器在小鼠胚胎、水稻或人細胞系中產(chǎn)生了大量的脫靶單核苷酸突變。LEAPER實現(xiàn)了高效編輯，而且同時很少發(fā)生全局性脫靶編輯。此外，它可能比需要引入外源蛋白的方法具有更低的免疫原性。

與Stafforst團隊在2019年1月報道的一種稱為RESTORE的RNA編輯方法相比，LEAPER中的arRNA可通過多種方式產(chǎn)生，包括化學合成和利用病毒載體或非病毒載體進行體內(nèi)表達，然而，RESTORE中的gRNA僅限于依賴于復雜化學修飾的化學合成反義寡核苷酸。

LEAPER的效率和特異性仍有改進空間。與招募ADAR的支架RNA（scaffold RNA）融合在一起的arRNA可能增加局部的ADAR蛋白濃度，從而提高編輯收益率。讓arRNA保持穩(wěn)定或增加它表達的方法可能進一步提高RNA編輯效率。作為一種單分子系統(tǒng)，LEAPER實現(xiàn)精確而又高效的RNA編輯，有潛力廣泛地適用于治療和基礎(chǔ)研究。

在幾天之前，美國麻省理工學院麥戈文腦科學硏究所研究員、布羅德研究所核心成員張鋒（Feng Zhang）及其團隊如今開發(fā)出一種稱為RESCUE（RNA Editing for Specific C to U Exchange, C→U交換特異性的RNA編輯）的策略：利用一種失活的Cas13將RESCUE引導到RNA轉(zhuǎn)錄本中的目標胞嘧啶堿基上，并使用一種新的、經(jīng)過進化的、可編程的酶將不想要的胞嘧啶（C）轉(zhuǎn)化為尿苷（U），從而指導RNA指令發(fā)生變化。RESCUE建立在REPAIR技術(shù)的基礎(chǔ)之上，其中REPAIR也是由張鋒團隊開發(fā)的，可將堿基腺嘌呤轉(zhuǎn)化為RNA中的肌苷（Science, 2017, doi:10.1126/science.aaq0180）。相關(guān)研究結(jié)果于2019年7月11日在線發(fā)表在Science期刊上，論文標題為“A cytosine deaminase for programmable single-base RNA editing”。

CRISPR家族酶Cas13在發(fā)揮作用。Cas13（粉紅色）是RESCUE平臺的核心，它使用特定的向

之前開發(fā)的REPAIR平臺使用靶向RNA的 CRISPR/Cas13將一種稱為ADAR2的RNA編輯器的活性結(jié)構(gòu)域引導至特定的RNA轉(zhuǎn)錄物，在那里它能夠?qū)⑾汆堰剩ˋ）轉(zhuǎn)換為肌苷（I），即A→I。由于不存在具有替代活性的天然編輯器，張鋒和他的同事們進行了REPAIR融合，并在實驗室中讓它進行進化，直到它能夠?qū)奏まD(zhuǎn)換為尿苷，即C→U轉(zhuǎn)換。

RESCUE能夠被引導至任何選擇的RNA，然后通過這種平臺中經(jīng)過進化的ADAR2組分執(zhí)行C→U編輯。張鋒團隊將這種新平臺導入到人細胞中，結(jié)果表明這能夠靶向人細胞中的天然RNA以及合成RNA中的24種臨床相關(guān)突變。然后，他們進一步優(yōu)化了RESCUE以減少脫靶編輯，同時最小程度地降低對在靶編輯的干擾。

綜上所述，魏文勝課題組開發(fā)的LEAPER工具和張鋒團隊開發(fā)的RESCUE工具能夠填補核酸編輯工具箱中的關(guān)鍵空白，有助于推動科學家們實現(xiàn)更精確的RNA編輯，并且最終有助于治療一系列由突變引起的疾病。（生物谷 Bioon.com）

參考文獻：

1. Liang Qu et al. Programmable RNA editing by recruiting endogenous ADAR using engineered RNAs. Nature Biotechnology, Published online:15 July 2019, doi:10.1038/s41587-019-0178-z.

2. Omar O. Abudayyeh et al. A cytosine deaminase for programmable single-base RNA editing. Science, Published online:11 July 2019, doi:10.1126/science.aax7063.

3. David B. T. Cox et al. RNA editing with CRISPR-Cas13. Science, Published online:25 Oct 2017, doi:10.1126/science.aaq0180.

4. Tobias Merkle et al. Precise RNA editing by recruiting endogenous ADARs with antisense oligonucleotides. Nature Biotechnology, Published online: 28 January 2019, doi:10.1038/s41587-019-0013-6.