 風(fēng)暴的基本概念一個(gè)相當(dāng)大的變化，Palm和FPALM已采用多種激勵(lì)計(jì)劃及合成熒光基團(tuán)和熒光蛋白的誘導(dǎo)暗態(tài)。 STORM成像的熒光探針 適合用于成像與暴風(fēng)相關(guān)的超分辨率方法的熒光探針是那些具有非常高的亮度和對(duì)比度的水平，在光漂白前每個(gè)分子的光子產(chǎn)生的最大數(shù)目，或返回到一個(gè)黑暗的，非熒光的狀態(tài)。對(duì)于所有的熒光基團(tuán)的摩爾消光系數(shù)和熒光量子產(chǎn)率，低疲勞率，和交換動(dòng)力學(xué)，很容易地控制。因此，在光漂白或光控暗狀態(tài)而言，最好的探針是那些失活可以平衡，以確保在任何特定時(shí)間，只有一小分子中是激活的激活率。 除了高亮度水平和光控穩(wěn)定性的要求，超分辨率探針必須是能夠擬定精度高的亞細(xì)胞目標(biāo)化，他們應(yīng)該具有盡可能低的背景噪聲水平。熒光蛋白，混合動(dòng)力系統(tǒng)相結(jié)合的一種基因編碼的目的肽與一個(gè)單獨(dú)的合成染料膜滲透物的組件，高度特異性的合成熒光團(tuán)（如MitoTrackers LysoTrackers SYTO熒光團(tuán)）是能靶向蛋白組裝或細(xì)胞器。 Abbkine公司的TrakineTM細(xì)胞染色試劑盒以及TrakineTM Pro活細(xì)胞試劑盒所用的染料完美的印證了這一功能。利用TraKine? Pro熒光探針，成功記錄STORM顯微鏡下成功觀測(cè)到活細(xì)胞細(xì)胞核/溶酶體和線粒體相互作用過(guò)程。為研究亞細(xì)胞器結(jié)構(gòu)之間的相互作用以及它們背后的分子生物學(xué)機(jī)制提供條件。得益于莊小威院士的啟發(fā)，Abbkine TraKine? Pro系列熒光染料應(yīng)運(yùn)而生，主要包括以下四個(gè)品類的產(chǎn)品。
屬性選擇合成探針STORM成像
影響因素STORM成像分辨率 STORM，PALM，F(xiàn)PALM的技術(shù)，如超分辨單分子成像的理論基礎(chǔ)雖然先前已詳細(xì)討論了，在確定任何特別的調(diào)查使用這些方法的實(shí)際結(jié)果的因素有很多。其中的關(guān)鍵方面是必須考慮的是，每個(gè)單獨(dú)的定位測(cè)量的準(zhǔn)確度，已被定位在最終圖像中（通常被稱為分子密度）的探針的密度，和標(biāo)簽本身的物理尺寸。分辨率和單分子定位精度之間的關(guān)系是很容易確定。能力解決兩個(gè)熒光分子作為單獨(dú)的實(shí)體的位置定位的精度，這決定了（不確定性）的每個(gè)分子中，從而對(duì)之間的距離是有限的。反過(guò)來(lái)，定位的精度，主要是依賴于單個(gè)激活-去激活周期收集的熒光分子的光子數(shù)，提供了背景噪聲可以忽略不計(jì)。 雙色彩風(fēng)暴成像 在熒光顯微術(shù)的主要優(yōu)點(diǎn)是容量乘以與一個(gè)以上的熒光基團(tuán)標(biāo)記的圖像樣本來(lái)生成圖像的二，三，四種顏色，幫助解開的相對(duì)的組織和不同的生物結(jié)構(gòu)或分子之間發(fā)生的相互作用。在兩個(gè)或兩個(gè)以上的熒光標(biāo)記探針駐留在同一決議體積的情況下，他們可以被視為經(jīng)典的共定位分析算法，以確定發(fā)射光譜之間的重疊程度。在兩個(gè)或兩個(gè)以上的顏色是必不可少的，用于探測(cè)生物分子之間的相互作用，并提供了寶貴的洞察許多生物過(guò)程的性質(zhì)，如果它可以成功地應(yīng)用到超分辨率成像。 三維風(fēng)暴成像 絕大多數(shù)生物結(jié)構(gòu)的三維實(shí)體，從而表現(xiàn)出橫向和軸向尺寸范圍在幾十微米或以上的功能，很容易解決的許多流行的成像方式在熒光顯微鏡。這種能力擴(kuò)展到單分子的超分辨成像，精確地確定一個(gè)機(jī)制來(lái)激活熒光橫向和軸向位置的境界是必要的。不幸的是，熒光團(tuán)的軸向位置上的準(zhǔn)確的信息是很難取得衍射受限的三維成像，因?yàn)榻蛊矫娓浇膮^(qū)域中的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)是對(duì)稱的。呈現(xiàn)確切位置的兩個(gè)分子位于焦平面上方或下方在納米之間難以區(qū)分。此外，該點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)也包含在焦平面附近的一個(gè)較大的區(qū)域（高達(dá)幾百納米）使其難以跨越的熒光有關(guān)的軸向位置的信息很少本地化分子居住的任何地方附近的寬視場(chǎng)顯微鏡的焦平面。 單分子風(fēng)暴型三維成像的另一種方法利用多焦點(diǎn)的平面成像，以實(shí)現(xiàn)軸向分辨率的衍射極限以下。通過(guò)同時(shí)成像在試樣中的兩個(gè)焦平面，激活的熒光團(tuán)的圖像可以被分析，以適應(yīng)一個(gè)三維點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)，以確定它們的空間坐標(biāo)。 活細(xì)胞STORM成像 進(jìn)行時(shí)間分辨的圖像序列捕獲的活細(xì)胞和組織的結(jié)構(gòu)是熒光顯微鏡的標(biāo)志成果之一，并可以實(shí)施與幾乎所有的對(duì)比度或光學(xué)切片模式，包括寬視場(chǎng)，激光掃描共聚焦，旋轉(zhuǎn)盤，總的內(nèi)部反射和多光子顯微鏡。 因?yàn)閐STORM利用常用的有機(jī)熒光基團(tuán)（如Cy5標(biāo)記的Alexa Fluor 488，ATTO 655）所表現(xiàn)出的的固有光控性能，是不要求精確共軛的第二熒光激活。因此，dSTORM可以產(chǎn)生衍射極限的下方，使用與選定的合成熒光標(biāo)記活細(xì)胞顯著高分辨率的圖像。該技術(shù)也被檢查翻譯用Cy5的Alexa Fluor 647標(biāo)記的微絲在體外吸附在玻璃表面，很容易轉(zhuǎn)換成應(yīng)用程序與其他常見的生物大分子沿肌球蛋白II網(wǎng)絡(luò)。 結(jié)論 STORM成像，將有一個(gè)直接關(guān)系到成功的活細(xì)胞觀察的另一個(gè)重要方面是數(shù)據(jù)采集速度。由于本征時(shí)間和空間分辨率之間的折衷，超分辨率成像一般是比較緩慢的。更具體地，構(gòu)造風(fēng)暴圖像繪制在許多成像幀的檢體中的寬視場(chǎng)視圖累計(jì)本地化。因此，成像速度在風(fēng)暴需要準(zhǔn)備一個(gè)高分辨率的圖像的幀的數(shù)量是有限的。相比之下，聚焦的光點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的工程技術(shù)，如STED，有限的時(shí)候需要掃描整個(gè)標(biāo)本的一個(gè)小的焦點(diǎn)。因此，單分子技術(shù)有望比STED相關(guān)的方法要快，成像時(shí)，一個(gè)大的標(biāo)本地區(qū)，但慢的時(shí)候成像面積小。目前，風(fēng)暴的最高分辨率圖像采集時(shí)間通常需要幾分鐘。然而，在60至70納米的空間分辨率，時(shí)間分辨的圖像的時(shí)間分辨率在活細(xì)胞中的幾十秒鐘的聚集。應(yīng)該預(yù)期將改善與成像速度更快的相機(jī)，較高的激發(fā)功率，探頭具有更快的光控率。 |
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
|
