NGS屬于“ 深度測序” , 可以1次并行對幾十萬甚至上百萬條DNA分子進(jìn)行序列測定, 從而實現(xiàn)每個位點被覆蓋幾十次甚至上百次。通過計算測序得到的堿基總量與測序區(qū)域大小的比值, 可以獲得測序的平均深度, 是評價測序質(zhì)量的重要指標(biāo)之一。測序深度的增加使得目標(biāo)區(qū)域覆蓋的讀長增多, 獲得區(qū)域的序列信息更為精確。然而, 測序深度的增加意味著測序成本的提高。因此, 在測序之前需對數(shù)據(jù)精確度和成本進(jìn)行綜合考慮, 根據(jù)臨床應(yīng)用需求選擇合理的測序深度。測序深度的選擇主要基于以下4個方面的考慮：

首先, 常規(guī)的測序項目采用普遍被接受或推薦的測序深度。正常組織全基因組測序建議的測序深度為10X~30X。有研究表明, 30X的測序深度可以覆蓋80%的全基因組信息, 基本滿足常規(guī)的全基因組測序需求^[1]。正常組織全外顯子測序的測序深度為100X~200X。轉(zhuǎn)錄組測序雖不以深度來衡量, 但對測序讀長數(shù)有明確的要求, 一般為百萬數(shù)量級。常規(guī)的染色質(zhì)免疫共沉淀測序則需要100X左右。這些測序深度都經(jīng)過多方驗證, 基本能滿足不同測序目的的數(shù)據(jù)需求。

其次, 特殊目的的測序項目可通過檢索文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫, 選擇與相關(guān)研究類似的測序深度, 如在開展循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA, ctDNA）檢測時, 可參考CAPP-Seq方法^[2]中的測序深度（10 000X以上）, 以保證可以覆蓋低頻率的ctDNA突變信息。開展高深度的腫瘤基因組測序, 可選擇60X~100X的測序深度。

再次, 根據(jù)已有的測序項目進(jìn)行深度優(yōu)化, 如根據(jù)已知現(xiàn)有Panel檢測項目靶向區(qū)域各堿基的深度分布情況, 90%以上的堿基覆蓋深度> 0.2（均值歸一化結(jié)果）, 要實現(xiàn)平均測序深度在10X以上的深度測序, 其實際測序深度則要達(dá)到50X（10/0.2=50）, 類似的策略可參閱illumina技術(shù)手冊^[3]。這種優(yōu)化策略對于新檢測項目的研發(fā)有重要的幫助。

最后, 根據(jù)測序目的選擇測序深度。例如我們開展的遺傳乳腺癌高危人群篩查項目, 采用靶向捕獲測序檢測血液樣本中的胚系突變, 由于胚系突變頻率理論值為0%、50%和100%, 此時采取較低的深度（200X）就可獲得該突變信息。但在腫瘤體細(xì)胞的突變檢測中, 由于腫瘤組織樣本中腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性和樣本純度等原因, 可能存在低頻率的體細(xì)胞突變（5%、1%, 甚至更低）, 為了獲得這些突變信息, 我們在腫瘤用藥指導(dǎo)檢測項目中采取深度測序, 保證1 000X以上的測序數(shù)據(jù)。

值得強(qiáng)調(diào)的是, 測序深度的增加往往意味著建庫階段PCR擴(kuò)增次數(shù)的增加, 會導(dǎo)致重復(fù)讀長的增多, 這些冗余數(shù)據(jù)不僅增加了數(shù)據(jù)處理的計算量, 同時會對變異檢測產(chǎn)生干擾?？傊? 測序深度不是隨意指定的, 在檢測項目的建立過程中, 必須根據(jù)項目需求選取合適的測序深度。同時, 在開展的檢測項目中, 必須對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量評估, 判斷其是否達(dá)到預(yù)期的測序深度, 深度不夠則必須補(bǔ)測, 若差異太大, 則必須重新測序。

靶向測序是通過捕獲或擴(kuò)增的手段抓取基因組特定區(qū)域的片段進(jìn)行NGS, 這個特定區(qū)域既可以是單個或多個基因, 也可以是全外顯子組甚至全基因組。必須注意的是, 由于現(xiàn)有的測序技術(shù)很難捕獲高GC區(qū)域、短重復(fù)片段等基因組區(qū)域, 全外顯子組測序和全基因組測序并不能完全覆蓋全外顯子組或全基因組區(qū)域, 最好的全基因組測序覆蓋度可達(dá)97%。Illumina 公司的外顯子組捕獲技術(shù)（TruSeq Exome）可實現(xiàn)99.45%的RefSeq、98.83%的一致性編碼序列（consensus coding sequence, CCDS）、99.68%的Ensembl、99.68%的GENCODE v19的覆蓋度。此外, 不同的全基因組或外顯子組捕獲體系, 如NimbleGen、Agilent、Illumina TruSeq和Illumina Nextera的捕獲效率/覆蓋度也存在差異^{[4, 5, 6, 7]}。

在測序過程中, 由于試劑差異、人員操作、儀器維護(hù)等因素, 實際的捕獲效率和覆蓋度也會與期望值存在偏差, 可能會捕獲到非目標(biāo)區(qū)域序列, 也可能漏捕目標(biāo)區(qū)域序列。非目標(biāo)區(qū)域序列對于靶向測序沒有意義, 而脫靶序列會導(dǎo)致測序信息缺失。因此, 對于任何檢測項目, 每一次測序必須給出靶向區(qū)域的覆蓋度統(tǒng)計, 這是衡量測序質(zhì)量的重要指標(biāo)之一。當(dāng)覆蓋度過低時, 則需補(bǔ)測數(shù)據(jù)或?qū)颖局販y。

值得強(qiáng)調(diào)的是, 靶向區(qū)域內(nèi)堿基覆蓋深度的分布并不是均勻的, 在靶向區(qū)域的5＇端和3＇端, 其測序深度較低, 甚至只有1個或幾個讀長覆蓋, 這種低深度的序列信息不能提供可靠的信息用于后續(xù)分析。因此, 在實際操作中, 評估測序的覆蓋度往往結(jié)合測序深度, 如靶向區(qū)域內(nèi)10X以上的覆蓋率。

測序深度和覆蓋度是大家比較關(guān)注和容易接受的質(zhì)控指標(biāo), 但測序數(shù)據(jù)中的重復(fù)率（即重復(fù)讀長在所有讀長中的比例）常被忽視。重復(fù)讀長出現(xiàn)的類型有2種：1種是文庫構(gòu)建前PCR擴(kuò)增的原因?qū)е碌耐耆粯拥淖x長; 另1種是比對到參考基因組上同一位置不同的讀長, 該現(xiàn)象可能是由測序錯誤、比對錯誤、等位基因等原因?qū)е碌? 即使讀長序列不一致, 但也被認(rèn)為是重復(fù)讀長。第1種重復(fù)讀長去除比較簡單, 可以根據(jù)序列是否一致來判斷。常用的數(shù)據(jù)質(zhì)控軟件FastQC就是根據(jù)該原理來估計數(shù)據(jù)中的重復(fù)率。第2種重復(fù)讀長來源復(fù)雜, 是否去除難以判斷, 如同一基因不同拷貝的片段, 其中1個拷貝發(fā)生突變, 其他拷貝無突變, 此時去掉重復(fù)讀長則會丟掉該變異信息。目前, 在博德研究所推薦的流程（GATK Best Practice）中, 建議去除重復(fù)讀長, 否則獲得的突變頻率可能會存在偏移, 見圖1。非真實的突變頻率會對腫瘤異質(zhì)性、克隆演化等研究數(shù)據(jù)產(chǎn)生重要影響。

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	圖 1 去除重復(fù)讀長導(dǎo)致的突變頻率偏倚

在實際數(shù)據(jù)分析中, Samtools、PICARD等軟件常用來統(tǒng)計數(shù)據(jù)的重復(fù)率和去除重復(fù)讀長。一般情況下, 靶向捕獲測序的重復(fù)率在20%以下, 如果低于10%, 說明數(shù)據(jù)質(zhì)量較好; 若重復(fù)率過高（達(dá)40%或60%）, 去除重復(fù)讀長后位點的實際測序深度會大大減少, 過低的測序深度難以保證突變位點的準(zhǔn)確信息。在我們的測序?qū)嵺`中, 擴(kuò)增子測序的平均重復(fù)率要高于捕獲測序的重復(fù)率：擴(kuò)增子測序的重復(fù)率通常為20%~50%, 而捕獲測序的平均重復(fù)率為10%~20%。因此, 不僅要關(guān)注有效數(shù)據(jù)的測序深度, 還需關(guān)注數(shù)據(jù)中的重復(fù)讀長比例, 以真實地評估樣本中的靶向區(qū)域是否被有效覆蓋。

在測序過程中, 測序儀會給每個堿基賦予1個質(zhì)量值, 代表這個堿基測序的準(zhǔn)確性。若堿基質(zhì)量值為20, 則表明該堿基有1%的可能性是錯誤的; 若堿基質(zhì)量值為30, 則表明堿基有0.1%的可能性是錯誤的。堿基質(zhì)量值與錯誤率的關(guān)系見圖2。

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	圖 2 堿基質(zhì)量值與錯誤率的關(guān)系

如果堿基質(zhì)量值較低, 對應(yīng)堿基測錯的概率會很高, 此時若該位點發(fā)生了突變, 則難以判斷該突變是真實發(fā)生的, 還是測序錯誤。因此, 統(tǒng)計數(shù)據(jù)中高質(zhì)量堿基的比例是衡量測序數(shù)據(jù)質(zhì)量的又一個重要指標(biāo)。Ion Proton測序儀要求的下機(jī)數(shù)據(jù)中, 堿基質(zhì)量值在20以上的堿基比例為80%; Illumina HiSeq系列測序儀的標(biāo)準(zhǔn)是堿基質(zhì)量值在30以上的比例要達(dá)到75%。

另外, 一些未測出的堿基以N表示。若讀長中未知堿基太多, 則讀長包含的有效信息減少。在數(shù)據(jù)分析前, 該讀長必須去掉, 否則會對后續(xù)分析造成影響。同時, 文庫構(gòu)建時添加的接頭序列也會出現(xiàn)在測序的原始數(shù)據(jù)中。這些接頭序列不是目標(biāo)區(qū)域和樣本的真實序列, 也必須去除掉, 否則會對真實的數(shù)據(jù)造成干擾, 影響后續(xù)的分析結(jié)果。

因此, 數(shù)據(jù)質(zhì)控不是單一指標(biāo)或操作即可完成的, 在數(shù)據(jù)較為復(fù)雜的情況下, 可能需要多步反復(fù)的處理才能獲得可靠有效的NGS數(shù)據(jù)。雖然國內(nèi)甚至全球還沒有建立統(tǒng)一規(guī)范化的NGS數(shù)據(jù)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn), 但數(shù)據(jù)產(chǎn)生后必須要有嚴(yán)格的質(zhì)控處理。各實驗室可以從堿基質(zhì)量、未知堿基、接頭序列、測序深度、測序覆蓋度、重復(fù)率等特征出發(fā), 根據(jù)實際需求建立自己的質(zhì)控策略。只有數(shù)據(jù)質(zhì)量合格, 才能保證后續(xù)數(shù)據(jù)分析的有效性和結(jié)果的可靠性。

NGS數(shù)據(jù)分析流程可大概分為3個步驟：比對、變異檢測和變異注釋。每個步驟可選的軟件很多, 涉及的算法也多種多樣。算法的差異性必然導(dǎo)致結(jié)果的不同, 如CHARLES 等^[8]比較了GATK（Unified Genotyper和Haplotype Caller算法）和VarScan 2種變異檢測算法, 二者在高質(zhì)量變異位點的結(jié)果一致性為84%~100%。SHANG等^[9]從運(yùn)行時間、使用內(nèi)存、比對準(zhǔn)確度3個方面對不同的NGS比對軟件進(jìn)行性能評估和比較, 發(fā)現(xiàn)BWA、Bowtie等軟件計算性能最高; Genomemapper、Novoalign等軟件具有高靈敏度; SOAP2、Novoalign軟件在處理錯配和indel區(qū)域具有明顯的優(yōu)勢。HWANG等^[10]對不同生物信息分析流程進(jìn)行研究, 發(fā)現(xiàn)每個流程均存在偏性。類似的研究還有很多^{[11, 12, 13, 14]}, 這提示我們需要正視分析方法不同所帶來的結(jié)果差異。

臨床檢測項目必須要求方法的穩(wěn)定性和標(biāo)準(zhǔn)化的操作流程。NGS檢測項目的監(jiān)管流程中也明確提出信息分析驗證, 只有通過驗證過程才能找到最適合數(shù)據(jù)的最優(yōu)分析方案（包括軟件的選擇和參數(shù)的設(shè)置）。因此, NGS檢測項目的數(shù)據(jù)分析流程需要固化, 以保證檢測結(jié)果的穩(wěn)定性和可靠性。

根據(jù)變異的來源可將其分為2類：胚系突變和體細(xì)胞突變。胚系突變又稱為生殖細(xì)胞突變, 是源于精子或卵子的生殖細(xì)胞的突變, 人體所有細(xì)胞都帶有該突變, 可以遺傳。體細(xì)胞突變, 又稱為獲得性突變, 是在生長發(fā)育過程中或環(huán)境因素影響下后天獲得的突變, 人體內(nèi)只有部分細(xì)胞帶有該突變。在開展遺傳性疾病的篩查或疾病風(fēng)險檢查時, 檢測的變異類型是胚系突變。用于腫瘤診斷和治療的NGS, 往往檢測的是腫瘤細(xì)胞中與正常細(xì)胞不一樣的體細(xì)胞突變, 這些突變位點可能是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的驅(qū)動突變, 也可能是靶向藥物的靶向位點。這些突變信息確實為腫瘤的診治提供了有效的幫助。

有研究表明, 一些重要的胚系突變在腫瘤組織中存在著較高的頻率, 如BRCA1和BRCA2突變約占乳腺癌的5%~10%, 約占所有遺傳性乳腺癌的50%^[15]。KANDOTH等^[16]在12種腫瘤中發(fā)現(xiàn)了一些罕見的胚系突變（包括BRCA1）, 這些突變的存在會增加患癌的風(fēng)險。ROBERT等^[17]在胰腺癌中發(fā)現(xiàn)了一些重要的胚系突變, 如ATM、BRCA和MLH1/2/6, 其中BRCA致病胚系突變的攜帶者對他莫昔芬和預(yù)防性乳房切除術(shù)有很好的治療效果。另外1個比較直觀的案例是：有研究在腫瘤患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）的T790M胚系突變^{[18, 19]}, 該位點是1個酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor, TKI）的耐藥位點, 若只參考體細(xì)胞突變結(jié)果會導(dǎo)致患者錯誤性應(yīng)用TKI, 延誤疾病的治療。雖然目前沒有明確的指南規(guī)定腫瘤NGS必須同時檢測胚系突變和體細(xì)胞突變, 但一系列的研究都表明胚系突變在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用, 因此有必要同時分析患者的胚系突變和體細(xì)胞突變, 從而更全面地評估腫瘤與變異間的關(guān)系。

2015年初, 美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會發(fā)布了一套變異分析分類系統(tǒng), 并推薦使用特定的標(biāo)準(zhǔn)術(shù)語^[20]：pathogenic（致病的）、likely pathogenic（可能致病的）、uncertain significance（致病性不明確的）、likely benign（可能良性的）、benign（良性的）來描述孟德爾疾病致病基因中發(fā)現(xiàn)的突變。針對每一個序列變異, 將已有的研究證據(jù)（如人群數(shù)據(jù)、計算機(jī)預(yù)測數(shù)據(jù)、功能數(shù)據(jù)、種族隔離數(shù)據(jù)等）整合, 對變異進(jìn)行分類。2016年初, MAHADEO等^[21]發(fā)布了一套腫瘤體細(xì)胞突變分類系統(tǒng), 從臨床可操作性、腫瘤原發(fā)位點/組織學(xué)、復(fù)發(fā)情況和變異效果4個方面將變異分為5類。類似的工作還有哈佛醫(yī)學(xué)院DIENSTMANN等^[22]總結(jié)的腫瘤體細(xì)胞突變標(biāo)準(zhǔn)化的決策系統(tǒng)。

這些分類或決策系統(tǒng)的基礎(chǔ)來源于已有的對于基因突變的認(rèn)識, 這些信息被整合進(jìn)數(shù)據(jù)庫或者潛藏在文獻(xiàn)、臨床試驗等信息中。常用的數(shù)據(jù)庫信息見表1。除此之外, 一些研究機(jī)構(gòu)會構(gòu)建自己的數(shù)據(jù)庫, 如美國國家人類基因組研究所（the National Human Genome Research Institute, NHGRI）建立的乳腺癌突變數(shù)據(jù)庫（the Breast Cancer Information Core, BIC）; 一些商業(yè)公司, 如23andme、Myrid、Foundation Medicine也通過整合公開數(shù)據(jù)和私有數(shù)據(jù), 建立自己的基因組變異注釋數(shù)據(jù)庫。

表 1 基因組變異、疾病、藥物相關(guān)數(shù)據(jù)庫

然而, 在高通量臨床檢測實踐中, 我們不能簡單地套用上述變異分析分類系統(tǒng), 也不能完全按照數(shù)據(jù)庫注釋來進(jìn)行臨床解讀。例如1個位點突變NM_000535.6（PMS2）：c.1621A> G（p.Lys541Glu）, 在Clinvar數(shù)據(jù)庫中注釋為良性胚系突變, 而在HGMD等數(shù)據(jù)里注釋為不明確的致病性突變, 如果只關(guān)注數(shù)據(jù)庫信息則很難判斷該位點的臨床意義。對于更復(fù)雜的情況, 如我們在臨床檢測中發(fā)現(xiàn)KIT基因的11號外顯子上發(fā)生K558_V559> N突變。該突變是1個新發(fā)突變, 未被任何數(shù)據(jù)庫收錄, 但根據(jù)對KIT基因結(jié)構(gòu)和功能的研究發(fā)現(xiàn), 該突變位點位于近膜區(qū), 且大量文獻(xiàn)已報道近膜區(qū)中絕大多數(shù)突變?yōu)橹虏⌒酝蛔?。因? 參考ACMG對基因變異致病性的劃分, 將KIT基因K558_V559> N定為中等變異的致病證據(jù)。由于KIT基因是靶向藥物伊馬替尼和伊馬替尼的作用靶點, 醫(yī)生可結(jié)合臨床實際, 對患者采取針對性的治療。總之, 變異位點的臨床解讀依賴于注釋所用的數(shù)據(jù)庫, 但不局限于數(shù)據(jù)庫, 可靠有效的臨床解讀需要數(shù)據(jù)庫和數(shù)據(jù)庫背后信息深度的挖掘和進(jìn)一步的人工解讀。

每個檢測項目在進(jìn)入臨床應(yīng)用之前, 都必須明確項目的檢測范圍、適應(yīng)人群、檢測目標(biāo)等, 同時進(jìn)行檢測性能驗證, 給出該項目的檢測敏感性、檢測特異性、測序深度、覆蓋度等指標(biāo)。Foundation Medicine公司的產(chǎn)品Foundation One可覆蓋236個基因的全外顯子區(qū)域以及19個基因的47個內(nèi)含子區(qū)域, 該產(chǎn)品可提供上述區(qū)域內(nèi)基因的位點突變、小片段插入/缺失（< 50 bp）、拷貝數(shù)變異和重排信息^[23]。然而, 該產(chǎn)品不能保證檢出低頻突變（如頻率< 1%的位點突變）。Thermo Fisher公司的Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel只覆蓋50個腫瘤相關(guān)基因的2 800個熱點突變, 因而只能提供這些熱點的突變信息。因此, 基因檢測不是萬能的, 通過NGS技術(shù)只能反映基因組上特定區(qū)域內(nèi)某一個或多個類型的遺傳變異。如果想獲得更為全面的遺傳信息, 可以組合采用不同的檢測項目。

值得強(qiáng)調(diào)的是, 大部分疾?。ò[瘤）都是涉及多基因影響的復(fù)雜疾病, 目前對其發(fā)生、發(fā)展分子機(jī)制的認(rèn)識猶如管中窺豹。因此, 在分子檢測的臨床實踐中, 有針對性地進(jìn)行基因檢測（如個體化用藥指導(dǎo)檢測等）對疾病的診斷和治療有明確的現(xiàn)實意義。在實際臨床應(yīng)用中, 我們必須掌握NGS技術(shù)中生物學(xué)數(shù)據(jù)質(zhì)量控制的重要把控環(huán)節(jié)和影響因素。期待在不遠(yuǎn)的將來, 使NGS能如同PCR一樣, 成為臨床應(yīng)用成熟的檢測手段。