簡介：

1.慢病毒是以HIV-1（人類免疫缺陷I型病毒）為基礎發(fā)展起來的基因治療載體；

2. 逆轉錄病毒載體；

3. 它對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力；

4. 在感染能力方面可有效地感染神經元細胞、肝細胞、心肌細胞、腫瘤細胞、內皮細胞、干細胞等多種類型的細胞。

形態(tài)結構：

侵染過程：

1.人工體外包裝生產慢病毒

慢病毒包裝的條件：

① 包裝細胞（HEK293T)

② 輔助質粒（RRE , REV, Vsvg)

③ 目的慢病毒質粒

④ 轉染

2. 過表達目的基因的慢病毒包裝

① 試劑：

1）包裝細胞（HEK293T)

2）輔助質粒（RRE , REV, Vsvg)

3）攜帶GFP基因CDNA的質粒（Fugw-GFP, Plx304)

4）脂質體轉染

② 步驟：

1)傳代293T細胞；

2)24h 后，取1.5 ml EP管，加入OPTI-MED，加入RRE , REV, Vsvg，加入攜帶表達目的基因的Fugw-GFP質粒，混勻，加入脂質體，吹打混勻；

3）靜止30min,加入到HEK293T 細胞，等待48 h；

4）收集上清即為慢病毒。

3.干擾目的基因表達的慢病毒包裝

①試劑：

1）包裝細胞（HEK293T)

2）輔助質粒（RRE , REV, Vsvg)

3）攜帶干擾目的基因表達的shRNA的質粒（Fugw, PLKO.1)

4）脂質體轉染

②步驟：

1）傳代293T細胞；

2）24h 后，取1.5 ml EP管，加入OPTI-MED，加入RRE , REV, Vsvg，加入攜帶干擾目的基因表達的質粒PLKO.1 ，混勻，加入脂質體，吹打混勻；

3)靜止30min,加入到HEK293T 細胞，等待48 h；

4）收集上清即為慢病毒。

1.慢病毒體外侵染步驟：

①細胞培養(yǎng)箱取出細胞到無菌操作臺；

②取慢病毒上清直接加入到目的細胞的培養(yǎng)基中，輕輕搖晃；

③把細胞放回培養(yǎng)箱，放置2-4 天。

2.慢病毒體外過表達侵染：

3.慢病毒體外干擾基因表達侵染：

1.滴度：指每毫升中含有的具有的病毒顆粒數

慢病毒濃縮

濃縮方法:

①超高速離心；

②PEG8000沉淀；

③超過濾。

2.滴度（Titer) 檢測

① 定量 PCR 法:

QuickTiter?慢病毒滴度試劑盒，檢測到的是總的慢病毒顆粒數目

② OD值：

分光光度計測OD ,檢測到的是總的慢病毒顆粒數；

③ 稀釋侵染:

稀釋慢病毒顆粒，侵染HEK293細胞，熒光成像分析或流失分析，檢測到的是具有生物活性的慢病毒顆粒數（TU/ML)。

1992年，慢病毒立體注射，首次成功侵染體內細胞成功表達目的基因。

GFP慢病毒立體注射剛出生小鼠，14天后GFP在體內神經元達。

GFP腺病毒立體注射小鼠，大面積表達GFP蛋白。

1.分子克隆

① 目的基因擴增

② 質粒載體雙酶切

③ 目的基因及載體連接和轉化

④ 質粒測序及表達鑒定

2.目的基因擴增（PCR ）

模板，引物，高保真酶體外擴增目的基因片段

3.限制性內切酶酶切

4.電泳和膠回收

5.連接

① 酶切后的載體與酶切后的目的基因進行連接

② 酶切后的載體與酶切后的目的基因進行連接步驟

6.轉化

① Add 5 ul  production into competence for 30 min

② 42 ℃ heat shock 45 s

③ Put into ice 2 min

④ Recovery 45 min

⑤ Plating in Ampicillin plate

7.菌落生長

連接成功后，載體是環(huán)狀，可以表達抗氨芐基因，可以在氨芐的培養(yǎng)基板上生長。

8.陽性菌落鑒定

設計引物，挑選菌落，菌落PCR鑒定陽性克隆菌落。

9.陽性克隆測序鑒定

10.陽性克隆測序與目的基因序列比對

11.陽性質粒表達鑒定

將構建成功的質粒，轉染到HEK293細胞，提取蛋白，WB檢測目的基因表達。