前言 間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)療法的功效越來(lái)越多地歸因于旁分泌,特別是外泌體。在這項(xiàng)研究中,我們研究了MSC外泌體在顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎(TMJ-OA)的免疫活性大鼠模型中調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng),傷害感受行為,髁突軟骨和軟骨下骨愈合中的作用。2月7日新加坡國(guó)立大學(xué)牙科學(xué)院團(tuán)隊(duì)在Biomaterials 上發(fā)表了“MSC exosomes alleviate temporomandibular joint osteoarthritis by attenuating inflammation and restoring matrix homeostasis”,文章觀(guān)察到外泌體介導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎TMJ的修復(fù)的特征在于疼痛的早期抑制和炎癥減少的變性,隨后是基質(zhì)表達(dá)和軟骨下骨結(jié)構(gòu)的持續(xù)增殖和逐漸改善,導(dǎo)致整體關(guān)節(jié)恢復(fù)和再生。使用軟骨細(xì)胞培養(yǎng),可以將外泌體介導(dǎo)的關(guān)節(jié)修復(fù)過(guò)程中的一些細(xì)胞活動(dòng)歸因于腺苷激活A(yù)KT,ERK和AMPK信號(hào)。 具體而言,MSC外泌體增強(qiáng)了IL-1β阻礙的s-GAG合成,并抑制了IL-1β誘導(dǎo)的一氧化氮和MMP13的產(chǎn)生。腺苷受體激活,AKT,ERK和AMPK磷酸化的抑制劑部分地消除了這些作用??傊?,觀(guān)察表明MSC外泌體通過(guò)精心策劃的作用機(jī)制促進(jìn)OA中的TMJ修復(fù)和再生,其涉及多個(gè)細(xì)胞過(guò)程以恢復(fù)基質(zhì)和整體關(guān)節(jié)穩(wěn)態(tài)。該研究證明了無(wú)細(xì)胞即用型基于外泌體的治療劑用于治療TMJ疼痛和變性的轉(zhuǎn)化潛力。 研究思路 Figure 1:體內(nèi)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的示意圖。(A)動(dòng)物模型的示意圖,顯示通過(guò)將30號(hào)針插入外耳道之前進(jìn)行注射到大鼠TMJ的上隔室中。 (B)將染料溶液注入TMJ的上隔室以確認(rèn)注射部位。 (C)為了誘導(dǎo)TMJ-OA,使用針頭將溶解在lPBS中的MIA注射到TMJ的上部隔室中。 2周后,可觀(guān)察到OA樣病變。此后,大鼠每周在lPBS或等體積的載體中接受外泌體的關(guān)節(jié)內(nèi)注射超過(guò)8周。假對(duì)照大鼠進(jìn)行假注射。每周進(jìn)行一次針對(duì)傷害性反應(yīng)的頭部退縮閾值的測(cè)量。對(duì)大鼠實(shí)施安樂(lè)死,并且在2周時(shí)收獲TMJ組織樣品用于轉(zhuǎn)錄組分析,并且在第2,4和8周收獲用于顯微CT,組織學(xué),免疫組織化學(xué)染色和組織形態(tài)學(xué)分析的TMJ組織樣品。 Figure 2:用MSC外泌體處理后的傷害性反應(yīng)的基因表達(dá)變化和時(shí)程分析。 (A)描繪了在2周處理后TMJ髁軟骨組織樣品中與炎癥,抗炎癥,軟骨形成,纖維化,基質(zhì)調(diào)節(jié),抗凋亡,增殖和疼痛相關(guān)的標(biāo)志物的早期基因表達(dá)變化。 (B)疼痛行為測(cè)量的示意圖。從最低力開(kāi)始的一系列細(xì)絲在耳前區(qū)域施用于大鼠以評(píng)估頭部撤回。 (C)用MSC外泌體處理后的時(shí)間依賴(lài)性傷害性反應(yīng)。在MIA誘導(dǎo)OA之前和在用MSC外泌體處理的時(shí)間過(guò)程中測(cè)量HWT。早在2周時(shí),與PBS處理相比,外來(lái)體處理迅速增加HWT,并且從第5周開(kāi)始將HWT逐漸改善至類(lèi)似于假對(duì)照的基線(xiàn)水平,并持續(xù)至治療后第8周。相比之下,OA + PBS組中的載體治療對(duì)HWT的恢復(fù)幾乎沒(méi)有影響。 Figure 3:MSC外泌體促進(jìn)OA中的TMJ修復(fù)和再生。組織病理學(xué)評(píng)估顯示MSC外泌體恢復(fù)了OA中的TMJ基質(zhì)合成。 (A)蘇木精和伊紅和甲苯胺藍(lán)染色,以及在第2,4和8周對(duì)α-SMA和MMP13的免疫組織化學(xué)染色。 (B)通過(guò)定量TB染色區(qū)域和TMJ髁軟骨中α-SMA +和MMP13 +細(xì)胞的百分比,s-GAG的面積沉積百分比。 (C)模型以說(shuō)明大鼠TMJ髁頭的前部,中部和后部區(qū)域。在不同區(qū)域測(cè)量髁高度。(D)在第2,4和8周時(shí)的樣品的Mankin評(píng)分。 (E)前椎間盤(pán)移位和骨贅的發(fā)生次數(shù) Figure 4:MSC外泌體恢復(fù)OA中的TMJ軟骨下骨體積和結(jié)構(gòu).在第2,4和8周收獲大鼠TMJ用于微CT分析。(A)矢狀面視圖。(B)髁突的俯視圖。(C)圖像骨體積(BV / TV),小梁厚度(Tb.Th),小梁分離(Tb.Sp)和小梁數(shù)(Tb.N)的比率。 Figure 5:MSM外泌體在TMJ修復(fù)期間抑制炎癥,促進(jìn)細(xì)胞增殖和減少細(xì)胞凋亡。 在第4周和第8周定量分析TMJ髁軟骨中的(A)IL-1β+,(B)iNOS +,(C)PCNA +和(D)CCP3 +細(xì)胞。 Figure 6:在IL-1β存在下MSC外泌體對(duì)髁突軟骨細(xì)胞的基質(zhì)生物合成活性的影響。 (A)體外處理軟骨細(xì)胞顆粒的時(shí)間表。(B)s-GAG / DNA的定量分析顯示MSC外泌體對(duì)IL-1β處理的軟骨細(xì)胞產(chǎn)生sGAG的劑量依賴(lài)性作用。 (C)針對(duì)DNA含量標(biāo)準(zhǔn)化的培養(yǎng)物上清液中NO產(chǎn)生的測(cè)量顯示外來(lái)體對(duì)IL-1β處理的軟骨細(xì)胞產(chǎn)生NO的劑量依賴(lài)性抑制作用。 (D)外泌體處理后測(cè)定培養(yǎng)上清液中MMP13的產(chǎn)生。 Figure 7:MSC外泌體部分地通過(guò)腺苷受體依賴(lài)性激活A(yù)KT和AMPK信號(hào)傳導(dǎo)途徑恢復(fù)IL-1β阻礙的基質(zhì)合成。 (A)體外處理軟骨細(xì)胞顆粒的時(shí)間表。 (B)通過(guò)茶堿抑制腺苷受體的Western印跡分析和AKT,ERK和AMPK磷酸化的半定量分析。 (C)sGAG / DNA,(D)NO / DNA和(E)MMP13 /蛋白質(zhì)的測(cè)量顯示,在茶堿存在下,MSC外泌體對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的基質(zhì)降解和炎癥的抵消作用減弱。 (F)WB和渥曼青霉素對(duì)AKT抑制的半定量分析。 (G)s-GAG/DNA,(H)NO/DNA和(I)MMP13 /蛋白質(zhì)的測(cè)量顯示外泌體處理誘導(dǎo)IL-1β處理的軟骨細(xì)胞中s-GAG合成增加和NO和MMP13產(chǎn)生減少,但這些作用被渥曼青霉素抑制AKT磷酸化所抑制。(J)蛋白質(zhì)印跡和U0126對(duì)ERK抑制的半定量分析。 (K)s-GAG/DNA,(L)NO/DNA和(M)MMP13/蛋白質(zhì)的測(cè)量顯示外泌體處理誘導(dǎo)IL-1β處理的軟骨細(xì)胞中s-GAG合成增加和NO和MMP13產(chǎn)生減少,但這些作用被U0126抑制ERK磷酸化所抑制。(N)蛋白質(zhì)印跡和化合物C對(duì)AMPK抑制的半定量分析.(O)s-GAG/DNA和(P)的測(cè)量NO/DNA和(Q)MMP13/蛋白質(zhì)顯示外泌體誘導(dǎo)的s-GAG合成的恢復(fù)和IL-1β處理的軟骨細(xì)胞中NO和MMP13產(chǎn)生的抑制通過(guò)化合物C抑制AMPK磷酸化而減弱。 結(jié)論 迄今為止,關(guān)于使用MSC外泌體進(jìn)行OA治療的研究?jī)H限于膝關(guān)節(jié),還沒(méi)有研究調(diào)查其用于TMJ-OA的研究。據(jù)我們所知,這是人類(lèi)MSC外泌體在TMJ-OA中的治療用途的首次證明。在這里,免疫活性大鼠模型中證明,MSC外泌體通過(guò)炎癥的早期減少介導(dǎo)骨關(guān)節(jié)炎TMJ的修復(fù)和再生,以抑制疼痛和組織變性,隨后增加增殖和基質(zhì)合成以恢復(fù)TMJ骨軟骨組織。具體而言,MSC外泌體減少炎癥基因如IL-1β的轉(zhuǎn)錄,減少炎性IL-β+和iNOS +細(xì)胞的存在,增加的PCNA +增殖細(xì)胞,減少CCP3 +凋亡細(xì)胞,減少M(fèi)MP13 +和ADAMTS5 +細(xì)胞,增加sGAG基質(zhì)合成和減少αTMJ-OA中的SMA +纖維化細(xì)胞。到8周治療結(jié)束時(shí),外泌體治療的髁突顯示髁突結(jié)構(gòu),基質(zhì)沉積和軟骨下骨完整性的顯著恢復(fù),與假手術(shù)組相當(dāng),并且與年齡匹配的幼稚TMJ髁非常相似。正如之前的所有研究一樣,沒(méi)有觀(guān)察到在完全免疫活性的動(dòng)物中使用異種人MSC外泌體的任何不良免疫反應(yīng)。 在OA發(fā)病機(jī)制中已經(jīng)確定,不良炎癥,分解代謝基質(zhì)降解和/或基質(zhì)合成減少,細(xì)胞凋亡和/或增殖減少加劇了疾病進(jìn)展和關(guān)節(jié)損傷。據(jù)報(bào)道,幾種促炎介質(zhì)包括IL-1β和TNF-α等細(xì)胞因子,以及活性氧和氮等活性代謝物,有助于OA的發(fā)生和發(fā)展。由于炎癥通常會(huì)升高,已知過(guò)量產(chǎn)生活性氮如NO會(huì)導(dǎo)致OA線(xiàn)粒體功能障礙,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變,基質(zhì)降解,細(xì)胞損傷和細(xì)胞凋亡。 由于茶堿的抑制不能以相同的程度抑制外來(lái)體介導(dǎo)的AKT,ERK和AMPK的磷酸化,外泌體介導(dǎo)的AKT,ERK和AMPK磷酸化也可能被其他外來(lái)體蛋白誘導(dǎo)。MSC外泌體貨物的分析揭示了多種蛋白質(zhì)和核酸,具有> 850種獨(dú)特的基因產(chǎn)物和>150種microRNA。多樣的蛋白質(zhì)組具有顯著的冗余。除CD73外,MSC外泌體還具有TGF-β和胰島素生長(zhǎng)因子(IGF),可能潛在地激活軟骨細(xì)胞中的AKT,ERK和/或AMPK信號(hào)通路。 與在其他疾病動(dòng)物模型中使用MSC外泌體一樣,TMJ-OA中的組織修復(fù)和再生也涉及廣泛的作用,所有這些效應(yīng)不太可能僅由外泌體CD73介導(dǎo)。將MSC外泌體的廣泛治療效果歸因于功能復(fù)雜的外泌體貨物,更具體地說(shuō)歸因于蛋白質(zhì)貨物。貨物蛋白主要參與細(xì)胞通訊,結(jié)構(gòu)和力學(xué),免疫調(diào)節(jié),代謝和組織再生。由于關(guān)節(jié)組織高度復(fù)雜并且由幾種細(xì)胞類(lèi)型組成,這種廣泛的生物活性分布賦予MSC外泌體與復(fù)雜TMJ中多種細(xì)胞類(lèi)型相互作用的潛力,并引發(fā)組織修復(fù)所需的多種細(xì)胞反應(yīng)。盡管這些單個(gè)分子中的每一個(gè)在外泌體的治療活性中的作用仍有待確定,但是貨物的組合功能復(fù)雜性為MSC外泌體提供了具有發(fā)揮其廣泛治療功效的潛力的令人信服的理由。 文章研究表明,關(guān)節(jié)內(nèi)注射MSC外泌體是治療TMJ-OA中疼痛和修復(fù)組織的有效方法,這為T(mén)MJ-OA的治療開(kāi)發(fā)“現(xiàn)成的”無(wú)細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)提供了理論基礎(chǔ)。由于MSC外泌體代表了一種新穎的“一流”治療方法,因此在制造,安全和監(jiān)管方面存在重大挑戰(zhàn)和考慮因素,并且正在積極討論和解決這些問(wèn)題。 全文鏈接 https://pan.baidu.com/s/1T14cFOcHz2s-zjv8_5k0vA EVs-Exosomes由蘇大,浙大, 法國(guó)居里研究所數(shù)位博士、博后及教授創(chuàng)建。 |
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來(lái)自: 生物_醫(yī)藥_科研 > 《外泌體》