不知不覺年算是過完了，這次離開家不知下次歸期又是何時，每每羨慕本地人家，可以隨時隨地回家，可以不用太長時間的奔波，可以在父母身邊?；丶?，一說起來就讓人很開心，雖然回家這星期特別忙碌，但是心情卻是無比放松，挨家挨戶的串親戚，哥哥，嬸嬸，姐姐，姐夫，東奔西跑的認(rèn)長輩，舅舅，舅媽，大爺，大娘，觥籌交錯的瞎聊天，來來往往，熱熱鬧鬧，甚是開心。

一年不見，小侄子竟會跑了，去年見還是抱在懷里，不順心就哇哇地哭，小侄女要上一年級了，還會背英語了，大侄女都要上初中了，好像會打扮自己了。?！，F(xiàn)在小孩子都坐滿一桌了，正如我們小時候，四五個哥哥姐姐在前面跑著玩，五六歲的我在后面開心的跟著，剛會跑的妹妹在后面喊著，姐，等等我，啪唧，又摔了一跤。。。

正如我們小時候，一大院子的人打牌，2定主，升級，拱豬，爭上游，你應(yīng)該先出3，xx拿錯牌了，還是xx打的好。。。正如我們小時候，初中以后學(xué)習(xí)壓力還是來了。。。正如我們小時候，那時候所有的家人都還在。仿佛看到了當(dāng)時的父母，是不是也像我們現(xiàn)在一樣年輕，是不是也在努力拼搏，為我們撐起一片天，是不是也曾想過多陪陪自己的父母。以后的自己不知道能不能做到像父母一樣那么優(yōu)秀，但是一定會多回家陪陪父母，父母在，人生尚有來處。。。

提蛋白的系列到現(xiàn)在就差不多結(jié)束了

核蛋白的提取也如之前一樣，自己配制和試劑盒提取都有提及。

• A液：5mM PIPES  pH 8.0， 85mM KCL， 0.5%NP40，1%cocktail

• B液：50mM Tris-Cl  pH 8.1， 10mM EDTA，1% SDS，1% cocktail

細(xì)胞樣品

• 1.如提取總蛋白一樣，棄去培養(yǎng)基，在培養(yǎng)皿中加入1ml冷的PBS，洗三次，再加入PBS。

• 2.用細(xì)胞刮盡可能刮下細(xì)胞，收集到1.5mlEP管中。預(yù)冷離心機(jī)，4℃，1,000g，離心4分鐘（為盡可能多的獲得細(xì)胞，可將離心后的上清再重復(fù)刮細(xì)胞一次）。

• 3.棄掉上清，將細(xì)胞重懸于A液中（加入的體積按10^6/200ul，10cm dish加1ml）。接4-7。

組織樣品

• 1.稱重20-100mg組織樣品，放入預(yù)冷的1.5ml 離心管中。

• 2.用預(yù)冷的PBS清洗組織樣品。500g離心5分鐘，棄去上清，使沉淀干燥。

• 3.加入適量A液。

• 4.冰上放置1h（不震蕩，可偶爾用槍輕吹，此時核膜沒有破），充分裂解。

• 5.４℃，1000g，20分鐘，上清為胞質(zhì)蛋白（蛋白濃度比較低，如需要檢測，建議先濃縮一下），沉淀為細(xì)胞核。

• 6.將沉淀重懸于100-200ul B液中，冰上放置30分鐘至1小時（每5分鐘震蕩一次），充分裂解；可以觀察到沉淀慢慢消失，溶液變澄清。

• 7.4℃，12,000g離心20分鐘，上清即為細(xì)胞核蛋白。

試劑盒提取1:PIERCE公司NE-PERTM核及胞漿蛋白抽提試劑盒（78835）

核蛋白提取步驟

細(xì)胞樣品

• 1.棄去培養(yǎng)基，在培養(yǎng)皿中加入1ml冷的PBS，洗三次，再加入PBS。

• 2.用細(xì)胞刮盡可能刮下細(xì)胞，收集到1.5mlEP管中。預(yù)冷離心機(jī)，4℃，1,000g，離心4分鐘。

用槍頭小心吸棄上清液（注意盡量吸干），細(xì)胞沉淀中按表格1加入冰冷CERⅠ溶液，接轉(zhuǎn)胞質(zhì)胞核分離步驟；
表格1，不同細(xì)胞量應(yīng)加入相應(yīng)體積緩沖液

組織樣品

1. 稱重20-100mg組織樣品，放入預(yù)冷的1.5ml 離心管中。

2. 用預(yù)冷的PBS清洗組織樣品。500g離心5分鐘，棄去上清，使沉淀干燥。

3. 按表格2加入適量胞漿提取緩沖液，電動勻漿器勻漿，去除沒有完全勻漿的組織碎片。接轉(zhuǎn)胞質(zhì)胞核分離步驟。
   表格2，不同組織樣品量應(yīng)加入相應(yīng)體積緩沖液
   

   

胞質(zhì)胞核分離步驟：

• 1.旋渦劇烈震蕩15秒（重懸細(xì)胞沉淀），冰上孵育10分鐘；

• 2.再加冰冷CERⅡ溶液；

• 3.旋渦劇烈震蕩5秒鐘，冰上孵育1分鐘；

• 4.旋渦劇烈震蕩5秒鐘，然后在16,000g（最大速度）離心5分鐘；

• 5.立即將上清液（胞漿蛋白）移入一預(yù)冷EP 管中（冰上）；

• 6.再次旋渦震蕩懸浮未溶解部分，然后，加入冰冷的NER溶液；

• 7.旋渦劇烈震蕩15秒×4，其間冰上靜置10分鐘；

• 8.16,000g離心10分鐘；

• 9.立即將上清液（核提取物）移入一預(yù)冷EP 管中（冰上）；-80℃保存。

試劑盒提取2：Invent 胞質(zhì)胞核分離試劑盒（Sc-003）

操作方法：

細(xì)胞樣品

• 1.貼壁細(xì)胞生長至融合度90-100%，將預(yù)冷的PBS直接加入細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中清洗細(xì)胞兩次，吸去上清。

• 2.按表格1將適量的胞漿提取緩沖液均勻的加入整個器皿表面，冰上靜置5分鐘。用吸頭吹打幾次后轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5ml離心管中。渦旋大力震蕩15秒。接轉(zhuǎn)胞質(zhì)胞核分離步驟。
  表格1，不同細(xì)胞量應(yīng)加入相應(yīng)體積緩沖液
  

  

組織樣品

• 1.稱重適量組織樣品，放入預(yù)冷的1.5ml 離心管中。

• 2.用預(yù)冷的PBS清洗組織樣品。3000rpm離心1分鐘，棄去上清，使沉淀干燥。

• 3.按表格2加入適量胞漿提取緩沖液，電動勻漿器勻漿，去除沒有完全勻漿的組織碎片。接轉(zhuǎn)胞質(zhì)胞核分離步驟。
  表格2，不同組織樣品量應(yīng)加入相應(yīng)體積緩沖液
  

  

胞質(zhì)胞核分離步驟

• 1.4℃，最高速離心5分鐘。

• 2.將上清液（上清為胞漿組份）轉(zhuǎn)移到一個新的預(yù)冷的1.5ml離心管中。將沉淀（可選優(yōu)化：用0.5ml預(yù)冷PBS重懸，10,000rpm，離心5分鐘清洗沉淀可以減少胞漿蛋白污染）中加入適量的胞核提取緩沖液，渦旋大力震蕩15秒，冰上孵育1分鐘。然后重復(fù)震蕩15秒，冰上孵育1分鐘四次。（如核蛋白提取濃度低，可適當(dāng)延長每次孵育及震蕩時間）

• 3.迅速將核提取物轉(zhuǎn)入到預(yù)冷的離心管套管中，14,000rpm，離心30秒。棄掉離心管柱。將核蛋白儲存于-80℃。一般產(chǎn)量1.5-2.5mg/ml。

核內(nèi)參推薦使用Lamin-B1，檢測核內(nèi)參請勿使用H3，已有文獻(xiàn)證實(shí)，線粒體中也含有H3，本試劑盒分離后，線粒體存在于胞漿組分，如用H3檢測胞漿，一定會檢出胞漿中有H3。

為什么會用兩種提核蛋白的試劑，是因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)用兩種方法提取的核蛋白都可以做Western blot，但是在做EMSA時，就發(fā)現(xiàn)后者的條帶比較淡，即使加量多一倍，仍然不如前者好，但是后者提取時間縮短很多。

之前總覺得需要什么就提取什么，其他的都沒有太在意就浪費(fèi)了，不過最近看了一篇，原來還可以這樣操作。
準(zhǔn)備試劑：

• A液：50 mM Hepes, 150 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 調(diào)整 pH至7.5

• B液：100 mM phosphate buffer, 150 mM NaCl, pH 8, 1.5% TritonX-100, 10% glycerol

操作步驟：

• 1.棄去培養(yǎng)基用PBS洗2次后，加入冷的A液。

• 2.在裂解液中用細(xì)胞刮子收集所有細(xì)胞，轉(zhuǎn)移裂解液至EP管，用21號針頭反復(fù)吹打裂解細(xì)胞。

• 3.1000g離心3min，將上清轉(zhuǎn)移至另一EP管(A管)，沉淀用適量含1%SDS A液溶解即可得到核蛋白。

• 4.將A管上清21460g，4 °C離心1h，即可得到胞漿蛋白（上清）和胞膜/骨架蛋白（沉淀）。
  對于沉淀根據(jù)需要有兩種處理，

• A. 將沉淀用含SDS的裂解液溶解，即可得到溶于SDS的胞膜/骨架蛋白。

• B. 將沉淀用含TritonX-100裂解液B液溶解，即可得到溶于Triton X-100（Sol）的胞膜/骨架蛋白，轉(zhuǎn)移上清后剩下沉淀使用含SDS裂解液溶解，即可得到不溶于Triton X-100（Insol）的胞膜/骨架蛋白。

終于，提蛋白暫時結(jié)束了，我也只是寫了自己常用的，以后接觸到新的提蛋白的組分和方式再來補(bǔ)充，下周二不見不散??。