沒有抗體也能做western blot，而且速度很快！

yjt2004us 2019-02-16

展開全文

報告中說，

Promega公司宣布，它已與麻省理工學院-哈佛大學Broad研究所簽署了一項非獨家許可協(xié)議，可銷售CRISPR-Cas9基因編輯的工具和試劑，為研究人員探索生物學提供了新工具。
根據這項協(xié)議，Promega計劃將Broad研究所的CRISPR-Cas9技術與自家的產品結合起來，將報告基因敲入任何細胞或細胞系的基因組中。他們的目標是讓研究人員能夠在生理學相關的表達水平上探索生物學。

處于好奇，我檢索了以下，發(fā)現Promega想要借助CRISPR-Cas9技術敲入的報告基因是Hibit，而且在2017年有文章發(fā)表。

所以，本次文獻閱讀就從這里開始。

在2012年，Promega科學家改造了深海蝦的體內的熒光素酶nanoluc，

這個酶比之前的螢火蟲熒光素酶，海腎熒光素酶都要小。

小歸小，但是他的活性是螢火蟲和海腎的100倍，靈敏度也十分高，檢測范圍跨越7個數量級，他們找到的反應底物是Furimazine：

基于這個新的熒光素酶，promega更新了他們的產品線。

回到本文的題目，假如我研究的蛋白表達量比較低而且沒有什么可靠的抗體怎么辦呢？比如，你發(fā)現了一個新的蛋白，但是豐度不高。

第一種方法就是，嘗試去做抗體，這個需要財力和運氣。
第二種方法就是，使用基因編輯技術把一個tag標簽蛋白接在內源性基因的后面，通過這個檢測這個tag標簽來實現檢測基因表達的目的。

我們很容易想到，標簽可以用綠色熒光蛋白GFP，這可是獲得了諾貝爾獎的。

讓人生氣的是，在科學研究中，幾乎每一個你拍案叫絕的idea都有人在你之前嘗試了。在2015年的NC上，有人把GFP定點插入到了基因組上，

但是，問題是，GFP有27Kda，對于一些小蛋白來說，就是龐然大物，想想一個10kDa的蛋白身上接著一個27Kda的GFP，如何施展拳腳。那就把它切開啊，變成大小亞基，把小的接在基因上就可以啦，對的，有人已經想到了，很絕望是不是，世上聰明人多了去了，每次我提出一個idea并且告訴老板沒有人做過時，老板總會說

果子哥，你要明確一下，是你傻還是問題傻，有可能是別人做了你不知道，或者是別人做了發(fā)現不可行。

所以，我很謹慎。

他們把GFP切成兩半，一半是GFP1-10，一半是GFP11，后者只有16個氨基酸，必須兩個碰在一起才能發(fā)光。

但是本文的作者說，他那個系統(tǒng)有問題：

1.GFP的檢測的靈敏度差，內源性蛋白，以及信號通路的蛋白，往往表達不高，所以GFP反映不出他們的表達。
2.GFP從表達到成熟能夠被檢測有點復雜，時間比較長，不能反應及時的變化，不能檢測出分子動態(tài)的檢測水平。

這個是在前言說的，我很喜歡看前言，那個是產生idea的地方，作者此時話頭一轉，說，我們的深海蝦的Nanoluc靈敏度特別強，只要你在，我就能檢測到你，正好可以彌補這個系統(tǒng)的缺陷。此時，作者承認，這個idea來自于別人，

做不到人無我有，就實現人有我優(yōu)。

接下來他們就開發(fā)了NaboBit技術

他們把這個nanoluc蛋白從156和157氨基酸之間切斷，變成了大小兩個亞基，此時他不發(fā)光了，但是合并在一起又可以發(fā)光。大的亞基叫l(wèi)arge bit，小的亞基只有11個氨基酸，編碼的蛋白只有1.3kDa?？茖W家對著11個氨基酸序列進行改造，又產生了兩個不同親和活性的基團，親和活性小的叫smBit，用于研究蛋白相互作用，不是本次的重點，親和活性高的那個叫Hibit，很小而且親和性高，十分適合作為蛋白標簽。本次就是講的他。

如何實現tag的內源性嵌入呢？使用Crispr/cas9技術。

以GAPDH為例，簡要步驟如下

設計crRNA

要獲取GAPDH的基因組序列，我們本次要把tag加載GAPDH的末尾

其中crRNA的設計有很多網站可以做

cas9的切割位點在pam序列前三個，這個切割位點需要在非翻譯區(qū)，最好切割位點能在插入位點的40nt之內。

設計修復模板

cas9切割基因組后，我們需要給他提供一個修復的模板

這個就是修復模板的設計，兩邊要有50-80nt的同源臂，中間的HiBiT序列需要promega授權獲取。
打開這個網址
http://www./HiBiT-synthesis
閱讀一下，他說這個序列不能商用，只能配合promega的產品使用，而且你不能截取其中的部分序列私自使用。同意之后，序列會發(fā)到郵箱。
如果有同學這么做了，一定要注意，這是商業(yè)公司，你簽署了這個協(xié)議就要遵守，要不然被發(fā)現了，promega公司會起訴你的學校，賠償上億。

準備 ribonucleoprotein (RNP) complex

這一步很簡單，其中tracrRNA ，cas9都是從IDT公司購買的成品，官網也是這么推薦的。

轉入細胞

官網推薦使用電轉，把這個復合體導入細胞。但是用化學轉染也是可以的。

檢測

24-48小時就可以檢測，配合promega的產品可以自由檢測蛋白。
可以像檢測熒光素酶一樣檢測細胞中蛋白的表達：

也可以實現活細胞的檢測

甚至可以實現不要抗體做western，轉模之后直接顯影。

宣傳手冊中還比較了和elisa的區(qū)別

綜合來說，這個方法的特點就是，方便快捷。

方便體現在，他用crispr/cas9, 但是她全程沒有用到分子克隆，因為這個Hibit 蛋白足夠小，修復模板不需要用質粒來提供，直接合成，其中cas9蛋白直接購買IDT公司的成品，這意味著，每一個科研團隊都有能力去嘗試。這也解釋了本文開頭的那個報道，他為什么要和Broad研究所合作獲得CRISPR授權，把cas9整合在這個產品中一起出售，用戶使用起來更加方便，可重復性更高。
快捷體現在，因為這個Hibit靈敏度很高，crispr/cas9之后，不需要篩選單克隆細胞株，直接基因編輯后24-48小時就可以檢測結果。大概有20%的細胞會被編輯，并且這個效率傳代后也能保持很多代。