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Western blot常見(jiàn)問(wèn)題集錦

 生物_醫(yī)藥_科研 2019-01-18

很多童鞋在做WB的時(shí)候,都會(huì)碰到一些奇奇怪怪的事情,有些事情可以解釋?zhuān)行┦虑?,?jiǎn)直是詭異到摸不著頭腦。下面小編給大家整理一些WB中的常見(jiàn)問(wèn)題,大家一起探討探討吧。

 

1、細(xì)胞裂解液主要組分有哪些?SDS、NP-40、TritonX-100有何作用?

 

答:細(xì)胞裂解液一般含有緩沖成分Tris,裂解成分(SDS、NP-40、TritonX-100等),以及蛋白酶抑制劑成分(PMSF等)。

SDS、NP-40、TritonX-100這三種去垢劑的作用是不同的,或者說(shuō)作用力量強(qiáng)弱不同。

SDS屬于離子型去垢劑,最厲害,基本可以把細(xì)胞完全破掉,DNA會(huì)釋放出來(lái),裂解液變得很粘稠。

NP-40是很溫和的去垢劑,1%濃度的基本可以破壞掉包膜,而對(duì)核膜破壞的作用弱,結(jié)合特定的buffer可以獲得胞漿蛋白。

TritonX-100的能力介于NP-40和SDS之間,偏向于NP40,也是常用的細(xì)胞裂解液成分之一,在保護(hù)蛋白活性方面有一定作用(SDS基本會(huì)使蛋白變性失活)。

 

2、Western 及 IP細(xì)胞裂解液、RIPA裂解液、NP-40裂解液、SDS裂解液的用途?

 

答:用于普通的Western 、IP或co-IP,我們推薦使用Western及IP細(xì)胞裂解液,該裂解液已被國(guó)內(nèi)各大研究機(jī)構(gòu)廣泛使用,用戶普遍反映很好。裂解細(xì)胞或組織后,沒(méi)有非常粘滯的透明狀DNA團(tuán)塊形成,不必采用超聲處理等就可以非常理想地用于后續(xù)操作。另外該裂解液裂解的產(chǎn)物也適合用于磷酸化,蛋白的Western 檢測(cè)。對(duì)于某些特殊蛋白的IP,如果發(fā)現(xiàn)Western及IP細(xì)胞裂解液效果不是非常理想,可以嘗試用RIPA裂解液(強(qiáng)、中或弱)或NP-40裂解液。如果發(fā)現(xiàn)IP的時(shí)候背景很高,即非特異的蛋白也被IP下來(lái),則需要選用裂解強(qiáng)度較高的裂解液,例如RIPA裂解液(強(qiáng)或中)。如果發(fā)現(xiàn)目的蛋白無(wú)法被IP下來(lái),則說(shuō)明裂解液的強(qiáng)度過(guò)強(qiáng),可以使用較為溫和的裂解液如RIPA裂解液(弱)或NP-40裂解液。對(duì)于某些難溶解蛋白的Western,如果發(fā)現(xiàn)Western及IP細(xì)胞裂解液效果不是非常理想,可以嘗試使用裂解強(qiáng)度更高的裂解液,例如RIPA裂解液(強(qiáng)、中)或SDS裂解液。

 

3、聚丙烯酰胺凝膠電泳的基本原理?

 

答:聚丙烯酰氨凝膠電泳簡(jiǎn)稱(chēng)為PAGE(Polyacrylamide gel electrophoresis),是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的一種常用的電泳技術(shù)。聚丙烯酰胺凝膠由單體丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺聚合而成,聚合過(guò)程由自由基催化完成。催化聚合的常用方法有兩種:化學(xué)聚合法和光聚合法?;瘜W(xué)聚合以過(guò)硫酸銨(AP)為催化劑,以四甲基乙二胺(TEMED)為加速劑。在聚合過(guò)程中,TEMED催化過(guò)硫酸銨產(chǎn)生自由基,后者引發(fā)丙烯酰胺單體聚合,同時(shí)甲叉雙丙烯酰胺與丙烯酰胺鏈間產(chǎn)生甲叉鍵交聯(lián),從而形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。

 

PAGE根據(jù)其有無(wú)濃縮效應(yīng),分為連續(xù)系統(tǒng)和不連續(xù)系統(tǒng)兩大類(lèi),連續(xù)系統(tǒng)電泳體系中緩沖液PH值及凝膠濃度相同,帶電顆粒在電場(chǎng)作用下,主要靠電荷和分子篩效應(yīng)。不連續(xù)系統(tǒng)中由于緩沖液離子成分,PH,凝膠濃度及電位梯度的不連續(xù)性,帶電顆粒在電場(chǎng)中泳動(dòng)不僅有點(diǎn)和效應(yīng),分子篩效應(yīng),還具有濃縮效應(yīng),因而其分離條帶清晰度及分辨率均較前者佳。不連續(xù)體系由電極緩沖液、濃縮膠及分離膠所組成。濃縮膠是由AP催化聚合而成的大孔膠,凝膠緩沖液為PH6.7的Tris-HCl,分離膠是由AP催化聚合而成的小孔膠,凝膠緩沖液為PH8.9 Tris-HCl。電極緩沖液是PH8.3 Tris-甘氨酸緩沖液。2種孔徑的凝膠、2種緩沖體系、3種PH值使不連續(xù)體系形成了凝膠孔徑、PH值、緩沖液離子成分的不連續(xù)性,這是樣品濃縮的主要因素。

 

4、怎樣才能把膠跑的非常漂亮,泳道都能很直,上樣的量和灌膠是否很重要,電壓有什么要求?

 

答:影響跑膠跑的質(zhì)量,有以下幾個(gè)因素:

1)  電壓,小的電壓會(huì)使膠的分子篩效應(yīng)得到充分發(fā)揮。電壓越小,條帶越漂亮,濃縮膠55V,分離膠75V就能跑得很好。

2)  膠的均勻度,膠越均勻,條帶越窄,分離越均勻。倒膠之前,一定要充分混勻,玻璃板一定要干凈,雙蒸水隔離時(shí),一定要比較輕地加上去,避免稀釋上層的分離膠。

 

5、western blot使用的膜哪種最好啊,PVDF好還是NC膜,如何選擇?

 

答:PVDF膜可重復(fù)使用,特別適合蛋白印跡,結(jié)合能力較強(qiáng),但價(jià)格比較昂貴。NC膜價(jià)格比較便宜,應(yīng)用較廣,結(jié)合牢固性差一些,韌性也不如PVDF,不能重復(fù)使用,但蛋白吸附容量高,親水性較好。都可以用麗春紅染色。

 

6、請(qǐng)問(wèn)一下PVDF膜和硝酸膜結(jié)合蛋白的原理是什么?

 

答:一般而言,硝酸纖維素膜是通過(guò)疏水作用來(lái)和蛋白質(zhì)相聯(lián),這樣的話,反復(fù)洗幾次后,蛋白容易掉下來(lái),結(jié)果較差。PVDF膜主要通過(guò)它膜上的正電荷和蛋白接合,同時(shí)也有疏水作用,但相對(duì)較弱。這樣的話,PVDF膜和蛋白接合較牢固,不易脫落,結(jié)果較好。

 

7、加甲醇的目的是什么?

 

答:加甲醇起著一定的固定作用,因?yàn)樾》肿拥鞍踪|(zhì)容易轉(zhuǎn)出去。(特別是在硝酸纖維素膜上,因?yàn)镹C膜結(jié)合蛋白質(zhì)的能力較弱)。

 

8、我想盡量提高轉(zhuǎn)膜的效率(我的實(shí)驗(yàn)要求轉(zhuǎn)到膜上的蛋白越多越好,不管是什么大小的蛋白)不知道有哪些辦法?

 

答:不管怎么轉(zhuǎn)都會(huì)存在蛋白轉(zhuǎn)移不完全(電壓過(guò)小、時(shí)間過(guò)短)或過(guò)度轉(zhuǎn)移(電壓過(guò)大、時(shí)間過(guò)長(zhǎng))的問(wèn)題,魚(yú)(小分子量)和熊掌(大分子量蛋白)不可兼得。建議把膠切成兩半,比如以35KD為界,分別進(jìn)行轉(zhuǎn)膜,下半時(shí)間短,上半時(shí)間長(zhǎng)一點(diǎn),應(yīng)該會(huì)好一些。

 

9、Western blot中濕轉(zhuǎn)和半干轉(zhuǎn)的方法區(qū)別?

 

答:半干式轉(zhuǎn)膜速度快,而濕式成功率高并特別適合用于分子量大于100KD的蛋白。

 

10、半干轉(zhuǎn)是否要求膜,濾紙,膠同樣大???因?yàn)槟z大小不一定規(guī)則,膜和濾紙會(huì)大一點(diǎn),那樣會(huì)不會(huì)短路?什么是短路?如何控制和發(fā)現(xiàn)短路呢?

 

答:可以相等,但是如果膜比凝膠大就比較容易形成短路了,上下兩層濾紙也不能因過(guò)大而相互接觸,這樣同樣會(huì)短路,電流不會(huì)通過(guò)膠和濾紙。轉(zhuǎn)移前和轉(zhuǎn)移過(guò)程中看看電壓就行,正常的半干是慢慢變高的,最后結(jié)束時(shí)一般是開(kāi)始的1.5-3倍都是正常的。一般buffer和濾紙選的對(duì)就不會(huì)短路。

 

11、麗春紅(Ponceau S)染色的原理及特點(diǎn)?

 

答:麗春紅染色(Ponceau S Staining Solution)可以用于PVDF膜、硝酸纖維素膜和醋酸纖維素膜上的蛋白的檢測(cè)。麗春紅帶負(fù)電荷,可以與帶正電荷的氨基酸殘基結(jié)合,同時(shí)麗春紅也可以與蛋白的非極性區(qū)結(jié)合,從而形成紅色的條帶。麗春紅對(duì)蛋白的染色是可逆的,染色后可以用蒸餾水,PBS或其它適當(dāng)溶液洗去。

 

12、如何更高效的監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)膜效率呢?

 

答:立春紅(也包括考染膠)的靈敏度和HRP-ECL體系的靈敏度相差太遠(yuǎn),即使立春紅染膜無(wú)顏色,也無(wú)法提示W(wǎng)B結(jié)果會(huì)不會(huì)失?。既灸z無(wú)顏色也不能說(shuō)明轉(zhuǎn)膜充分了,除非你銀染),你仍然得繼續(xù)后面的操作;相反靶蛋白區(qū)域有顏色,亦無(wú)法提示靶蛋白就轉(zhuǎn)膜完全了,也許只是另外一個(gè)分子量大小相近的蛋白。因此,無(wú)論立春紅染膜失敗或成功,你都必須進(jìn)行后續(xù)的操作。而立春紅染膠不僅增加額外的操作時(shí)間,而且增加一輪漂洗的操作,對(duì)膜和膜上的蛋白都不好。

 

除了立春紅染色外,你還可以選擇預(yù)染Marker來(lái)監(jiān)測(cè)你的轉(zhuǎn)膜效率。理論上,同時(shí)轉(zhuǎn)膜、顏色是交聯(lián)到蛋白上的,因此顏色有多深表明有多少蛋白轉(zhuǎn)印到膜上,非常直觀、不會(huì)增加任何額外的操作(固定marker的上樣量非常必要)。

 

13、抗體孵育緩沖液的選擇?

 

答:某些實(shí)驗(yàn)室傳統(tǒng)上在封閉液中孵育抗體,而有些實(shí)驗(yàn)室用不含封閉劑的TBST來(lái)孵育抗體,結(jié)果因抗體而異,有時(shí)兩者結(jié)果相同,有時(shí)結(jié)果不同。如果不存在高背景的問(wèn)題,某些抗體用含低濃度(0.5 – 0.25%)脫脂奶粉或 BSA的封閉液來(lái)稀釋?zhuān)僧a(chǎn)生相對(duì)更強(qiáng)的信號(hào)條帶。


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