作者：黃山

      單位：貴州省臨床檢驗中心

一、激酶組學(xué)定義

       蛋白激酶是細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵組成部分，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化、代謝及生存等重要生物學(xué)過程。激酶組是指細(xì)胞或組織中所有激酶的總稱。激酶組學(xué)是研究激酶組的學(xué)科，包括激酶的豐度、活性、底物特異性、磷酸化狀態(tài)及氨基酸突變。目前人激酶組由568種基因編碼組成，其中約50%激酶定位于疾病基因位點。由于基因擴(kuò)增或突變引起的蛋白激酶活性失調(diào)與許多疾病的發(fā)生相關(guān)，包括炎癥、糖尿病及各種腫瘤，因此，人激酶組被認(rèn)為是藥物靶點的潛在資源庫。靶向激酶的小分子抑制劑已成功用于腫瘤治療。

       蛋白激酶又稱蛋白質(zhì)磷酸化酶，是一類催化蛋白質(zhì)磷酸化反應(yīng)的酶。蛋白激酶催化結(jié)構(gòu)域一般都是由 250~300 個氨基酸殘基組成，它們在催化結(jié)構(gòu)域的核心處有很大的相似性，但催化活性中心在激酶中的位置并不相同。蛋白激酶能把ATP 上的γ-磷酸轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)分子的氨基酸殘基上。ATP 上的腺嘌呤能通過氫鍵結(jié)合于激酶的活性位點。 活性位點處的鎂離子是磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移所必需。ATP 的結(jié)合發(fā)生在激酶N端和C端鏈接區(qū)。激酶在該鏈接區(qū)有一個保守激活環(huán)，其磷酸化程度與其催化活性高度相關(guān)。人激酶組共分為 9 大類，包含 134 個家族和196 個亞家族。 這 9 類分別是：①AGC 類，根據(jù)激酶家族成員名稱命名， 包括蛋白激酶 A（proteinkinase  A，PKA）、PKG 和 PKC； ②鈣離子/鈣調(diào)蛋白調(diào)節(jié)激酶 CAMK 類 （calcium/Calmodulin  regulated  kinases）和結(jié)構(gòu)相關(guān)激酶家族 ； ③酪蛋白激酶 1（casein kinase 1，CK1）；④CMGC, 根據(jù)激酶家族成員命名, 包括細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶（cyclindependent kinase，CDK）、 促分裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase, MAPK）、 糖原合成酶激酶 3（glycogen synthase kinase 3, GSK3） 和CDC 樣激酶（CDC-like kinase，CLK）；⑤受體鳥苷酸環(huán)化酶（receptor guanylate cyclases，RGC）；⑥STE，MAPK 級聯(lián)反應(yīng)激酶， 來源于酵母 Ste7（MAP2K）、Ste11（MAP3K）和 Ste20（MAP4K） 激酶。 MAP4K 的Raf 家族與 Ste20 家族激酶結(jié)構(gòu)不同，分類于酪氨酸激酶樣組（tyrosin kinase like，TKL）；⑦酪氨酸激酶（tyrosine kinase，TK），所有激酶的激活形式有酪氨酸磷酸化和序列相似性；⑧TKL，這類激酶與 TK很接近，是除“其他”激酶外最富多樣性的一類激酶； ⑨非典型激酶, 非典型激酶的激酶域與真核生物蛋白激酶沒有顯著的序列相似性。 激酶分類主要根據(jù)激酶催化結(jié)構(gòu)域的序列比對、序列相似性、催化結(jié)構(gòu)域以外結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)知識、已知的生物學(xué)功能以及與酵母、蠕蟲和果蠅激酶組的分類相似性也有一定的幫助。 對所有激酶基因的染色體位點分析表明，有 100多種激酶為主要的原癌基因，約 30 種為抑癌基因。在上述各類激酶中，TK 有 90 種，其中有 40 多種屬于原癌基因。 由于與疾病的密切關(guān)系，研究最為深入，其功能失調(diào)的因素主要包括 4 個方面： 激酶氨基酸突變或缺失； 激酶過表達(dá)； 空間結(jié)構(gòu)變化失調(diào)；基因組重排，如染色體位移。盡管人激酶組被認(rèn)為是潛在藥物靶點的豐富來源，主要研究仍集中于少部分激酶，只有 10%的激酶已經(jīng)或正在進(jìn)行與臨床有關(guān)的評價。 大部分的人激酶組仍有待鑒定。研究人員已繪制出完整的人體蛋白激酶圖譜，蛋白激酶基因約占去了人類全部基因的1.7%。應(yīng)用蛋白質(zhì)組技術(shù)深入研究激酶組，將親和富集與質(zhì)譜技術(shù)相結(jié)合，在生理狀態(tài)下研究激酶豐度及磷酸化水平。通常情況下，將一個或多個廣譜小分子激酶抑制劑偶聯(lián)于固相載體（如瓊脂糖凝膠），親和富集細(xì)胞或組織中的所有激酶，然后通過質(zhì)譜鑒定或定量。該方法可用于激酶抑制劑藥物或藥物候選物的靶點專一性及耐藥機(jī)制研究，為深入研究藥物作用機(jī)制及尋找聯(lián)合用藥新靶點提供依據(jù)。對人激酶組及腫瘤激酶組無偏見、全景式分析能幫助發(fā)現(xiàn)更多新藥靶點，以及激酶活性譜與腫瘤治療的相關(guān)性，為個體化治療提供依據(jù)。

二、激酶組學(xué)與檢驗技術(shù)

      激酶組學(xué)的研究主要包括在基因或蛋白水平的研究。在基因水平，癌基因組測序和定量 PCR 可用于突變分析，RNA 干擾可用于研究激酶的功能。 在蛋白水平，包括抗體芯片法、肽段芯片法及基于化學(xué)蛋白組技術(shù)的激酶組研究方法。抗體芯片法可用于大規(guī)模（＞300 激酶）分析重組激酶的底物特異性；肽段芯片法可用于研究已知激酶、組織或細(xì)胞中的激酶活性；化學(xué)蛋白組技術(shù)能夠檢測激酶豐度和對激酶磷酸化程度及位點進(jìn)行分析?；瘜W(xué)蛋白質(zhì)組技術(shù)是一種新的深入研究激酶組的策略，能夠?qū)っ附M進(jìn)行非定向、全景式研究，有助于未知功能激酶的發(fā)現(xiàn)。而這些相關(guān)研究技術(shù)，與醫(yī)學(xué)檢驗技術(shù)密切相關(guān)，也是檢驗技術(shù)的具體應(yīng)用，或者說檢驗技術(shù)在激酶組學(xué)研究中得到拓展。

三、獲悉蛋白激酶組的方法

       依靠高通量篩選試驗來快速而精確地研究整個蛋白激酶組已經(jīng)應(yīng)用到藥物研發(fā)的各個階段，激酶組學(xué)也應(yīng)運而生。應(yīng)用這種技術(shù)能在幾天內(nèi)拿到一個化合物對317個激酶的一直圖譜，相當(dāng)快速而精確，但不能保證所有用激酶組學(xué)技術(shù)找到的藥物都進(jìn)入臨床測試期。

四、基于化學(xué)蛋白質(zhì)組技術(shù)的激酶組研究方法

       化學(xué)蛋白質(zhì)組技術(shù)是指借助小分子化合物與蛋白質(zhì)的特異性相互作用富集蛋白，然后通過質(zhì)譜分析鑒定富集的所有蛋白質(zhì)的技術(shù)。許多激酶抑制劑為小分子化合物，將激酶抑制劑固定于不同載體，如葡聚糖凝膠或瓊脂糖凝膠等，富集激酶后經(jīng)質(zhì)譜四1鑒定，即為基于化學(xué)蛋白質(zhì)組技術(shù)的激酶組研究方法。對激酶的磷酸化的研究則需要富集磷酸化肽段，應(yīng)用最廣泛的富集方法是固相金屬親和色譜（IMAC）和TiO2。這是一種新的深入研究激酶組的策略，與磷酸化蛋白組技術(shù)結(jié)合，即可研究激酶組的磷酸化水平及位點。

五、化學(xué)蛋白質(zhì)組技術(shù)在激酶組研究中的應(yīng)用

1.分子靶向藥物或候選物作用靶點專一性研究

      自2007年以來，越來越多的研究人員應(yīng)用化學(xué)蛋白質(zhì)組技術(shù)進(jìn)行激酶組研究。主要分為2種，一種是單個抑制劑的選擇性研究，研究對象往往是已經(jīng)或即將用于臨床的藥物或藥物候選物。藥物的靶向特異性（也即選擇性）對藥物藥效發(fā)揮及副作用具有重要影響。

      伊馬替尼是最早批準(zhǔn)用于治療CML的小分子抑制劑，開創(chuàng)了靶向治療腫瘤的新時代。伊馬替尼對80%的CML患者有效，但是服用一段時間后許多患者會產(chǎn)生耐藥性，從而使病情惡化。達(dá)沙替尼是一種用于治療伊馬替尼耐藥的CML的小分子激酶抑制劑。奧地利Superb-Furga實驗室的Hantsehel等用上述化學(xué)蛋白組技術(shù)研究了白血病細(xì)胞系K562細(xì)胞中能與達(dá)沙替尼結(jié)合的蛋白激酶，發(fā)現(xiàn)除BCR-ABL，c-Abl，Arg （ABL2）和幾個Src激酶外，2個Tec激酶（ Btk和Tec）是達(dá)沙替尼最主要的相互作用蛋白。體外激酶實驗及體內(nèi)細(xì)胞實驗證明達(dá)沙替尼確實是Btk和Tec的抑制劑。達(dá)沙替尼和尼洛替尼是二代CML治療藥物，用于治療對伊馬替尼耐藥的CML患者。Superb-Furga實驗室應(yīng)用相同的技術(shù)研究了上述3種CML治療藥物的激酶譜，用于預(yù)測其潛在的副作用及新的藥物作用。研究結(jié)果表明，這3種藥物的相互作用激酶譜明顯不同，只有已知發(fā)揮藥物作用的ABL激酶相同。達(dá)沙替尼結(jié)合了30多種酪氨酸和絲/蘇氨酸激酶，包括免疫系統(tǒng)的主要調(diào)節(jié)因子，提示達(dá)沙替尼對免疫功能或許有特定影響。另外，酪氨酸受體激酶DDR1被證明是尼洛替尼的一個主要靶點。

 2.大規(guī)模腫瘤細(xì)胞激酶組或人激酶組研究

       另一種是運用多種低選擇性的抑制劑混合物富集細(xì)胞或組織內(nèi)的所有激酶，然后用高性能質(zhì)譜進(jìn)行鑒定，這是真正意義上的激酶組研究。Daub實驗室最先建立了該技術(shù)并研究了Jurkat，HCT-116和A549細(xì)胞中的激酶組表達(dá)譜，共鑒定140個激酶。

3.抗腫瘤激酶抑制劑藥物耐藥機(jī)制

       抗腫瘤激酶抑制劑藥物耐藥機(jī)制研究是激酶組及磷酸化激酶組研究的最新應(yīng)用。小分子激酶抑制劑是目前最主要的抗腫瘤藥物，有130多種小分子抑制劑正在進(jìn)行臨床或臨床前實驗。小分子抑制劑藥物最大的問題在于其容易產(chǎn)生耐藥性，其機(jī)制可能是其他信號通路的激活或激酶發(fā)生突變而降低了與抑制劑的結(jié)合。例如，人們觀察到了特定激酶抑制后RTK和其他信號通路的激活，這種激酶組的重編程阻止了對原癌基因的抑制。Duncan等用基于化學(xué)蛋白組的激酶組技術(shù)研究了細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（MEK）抑制劑AZD6442在治療三陰乳腺癌時的耐藥機(jī)制。他們通過研究AZD6442對三陰乳腺癌細(xì)胞系，臨床前的腫瘤模型以及人腫瘤組織中激酶表達(dá)譜的變化發(fā)現(xiàn)，用AZD6442抑制MEK一段時間后整個激酶組會重編程，其中RTK的激活是其主要耐藥機(jī)制。同時抑制MEK和RTK能夠誘導(dǎo)腫瘤抑制，這為臨床聯(lián)合用藥提供了科學(xué)依據(jù)。Cooper等應(yīng)用相同的技術(shù)研究了伊馬替尼敏感及耐藥的白血病細(xì)胞株的激酶譜變化，共定量150多種激酶，其中35種激酶有顯著變化。進(jìn)一步實驗證明酪氨酸激酶Lyn的上調(diào)與伊馬替尼的耐藥有關(guān)，通過小分子抑制劑或shRNA敲低伊馬替尼耐藥細(xì)胞株中的Lyn，可降低NF-KB信號通路的激活從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

       總之，激酶組重編程是抗腫瘤小分子抑制劑產(chǎn)生耐藥的主要原因之一，通過對抑制劑耐藥與敏感激酶譜比較研究可為抗腫瘤聯(lián)合用藥的提供依據(jù)。

       隨著富集技術(shù)的優(yōu)化，尤其是質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，基于化學(xué)蛋白組技術(shù)的激酶組研究范圍將越來越廣，可應(yīng)用于任何組織或細(xì)胞，研究深度也會不斷增加，從鑒定、定量到各種翻譯后修飾的研究，包括磷酸化、泛素化和乙酞化等。目前，對激酶的翻譯后修飾研究主要是磷酸化，因為其對激酶的功能發(fā)揮有重要作用。但是，泛素化、乙酰化等翻譯后修飾對普通蛋白質(zhì)的功能發(fā)揮起重要作用，對激酶的功能發(fā)揮也可能起重要作用，值得進(jìn)一步研究。另外，限于檢測手段、關(guān)注熱點等原因，僅有約10%激酶有臨床潛在價值報道，其他大部分激酶的臨床潛在價值有待發(fā)掘。

       激酶是細(xì)胞中最重要的蛋白質(zhì)類別之一。它們在細(xì)胞信號傳導(dǎo)中發(fā)揮作用，對從細(xì)胞生長到發(fā)炎等各個過程進(jìn)行調(diào)控。不過，更加重要的是，當(dāng)激酶的功能出現(xiàn)偏差時，在某些人類癌癥中會發(fā)現(xiàn)其蹤影，因此，它已經(jīng)成為制藥公司多年來高度關(guān)注的新藥靶標(biāo)。激酶組學(xué)是一門比較新的學(xué)科，它主要借助于高通量篩選技術(shù)迅速而準(zhǔn)確地對整個激酶組(細(xì)胞中全部激酶的集合)進(jìn)行研究。

一、 藥物篩選
        制藥企業(yè)正在已知的人類激酶組平臺上研發(fā)新的激酶抑制劑?，F(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了518種人類激酶，通過高通量激酶組篩選分析，可以發(fā)現(xiàn)能夠?qū)Σ煌っ府a(chǎn)生抑制作用的化合物，根據(jù)適應(yīng)癥的不同，這種抑制作用或者具有較強(qiáng)的特異性，或者是針對某一種類。為了獲得激酶抑制劑，制藥企業(yè)可以對某種化合物應(yīng)用高端儀器進(jìn)行高通量篩選。可收到該化合物對各種激酶的抑制分析結(jié)果。

二、 藥物設(shè)計
        有人稱激酶組學(xué)的出現(xiàn)實際早于基因組學(xué)，因為高通量激酶組分析在人類基因組測序完成以前就已經(jīng)存在。因此，激酶組學(xué)可能在前基因組時代就幫助過人們進(jìn)行藥物設(shè)計。英國Glasgow大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心分子寄生蟲學(xué)Wellcome中心的Christian Doerig博士是在前基因組時代就將激酶作為靶標(biāo)開展研究的科學(xué)家之一?；蚪M時代對瘧原蟲基因組的測序研究為Doerig提供了一份詳盡的潛在藥物靶標(biāo)清單，而瘧原蟲激酶與人類宿主激酶之間缺乏同源性使得Doerig的研究令人矚目。在這種情況下，化學(xué)療法干預(yù)具有更多的機(jī)會，Doerig表示：“我們在瘧原蟲中發(fā)現(xiàn)的很大比例的激酶被稱作孤兒激酶(orphan kinases)，意即它們與任何在人體細(xì)胞或者酵母中發(fā)現(xiàn)的明確的激酶群體沒有關(guān)聯(lián)。”

       Doerig運用反向遺傳學(xué)，系統(tǒng)地敲除全部的65個瘧原蟲激酶，對靶標(biāo)進(jìn)行驗證，以確定哪些瘧原蟲激酶在無性生命周期以及人體紅血球細(xì)胞發(fā)病機(jī)理中是必需的。他還通過大腸桿菌對激酶進(jìn)行表達(dá)，然后檢測其在高通量激酶組學(xué)分析中的反應(yīng)。這通常需要幾個月的時間才能確定少數(shù)激酶的功能。不過，Doerig迄今已經(jīng)研究了約1/3的瘧原蟲激酶。每當(dāng)他獲得一種活性激酶，就將其送出去進(jìn)行高通量篩選以發(fā)現(xiàn)新的抑制劑。

      盡管還只是一門比較新的學(xué)科，基于激酶組學(xué)的藥物研究已具有很高的可信度。不過，它用于藥物研發(fā)的前景如何？一位研究人員這樣說：“如果你看一下激酶的現(xiàn)狀，你將會發(fā)現(xiàn)應(yīng)用激酶抑制劑在一些癌癥領(lǐng)域已經(jīng)取得成功，但缺點是副作用很大?！倍贕oldstein看來，激酶抑制劑還與充血性心力衰竭有關(guān)。如果能夠通過激酶組學(xué)進(jìn)行預(yù)測，進(jìn)而在設(shè)計分子時避免那些激酶，就能夠避免副作用。

       考慮到公眾對制藥行業(yè)研發(fā)藥物安全性的擔(dān)心，激酶組學(xué)若能實現(xiàn)這一點將是藥物研發(fā)領(lǐng)域的一大飛躍。