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轉(zhuǎn)錄組測序中生物學(xué)重復(fù)如何來設(shè)

 小夢想在努力 2018-12-28

1.區(qū)分生物學(xué)重復(fù)與技術(shù)重復(fù)

      生物學(xué)重復(fù):指樣本重復(fù),比如3只小鼠,同時(shí)做一種處理,就是三個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

      技術(shù)重復(fù):一般是三次實(shí)驗(yàn),比如對一塊組織,提了三次RNA,做三次real time。

轉(zhuǎn)錄組測序中生物學(xué)重復(fù)如何來設(shè)

2.設(shè)置生物學(xué)重復(fù)的意義

由于新一代測序技術(shù)的優(yōu)越性以及高成本,曾一度忽略了“生物學(xué)重復(fù)”的重要性。但生物學(xué)重復(fù)對于測序?qū)嶒?yàn)的設(shè)計(jì)以及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的解讀和分析都非常重要。

設(shè)置生物學(xué)重復(fù):

能夠消除組內(nèi)誤差:生物學(xué)重復(fù)可以測量變異程度

增強(qiáng)結(jié)果的可靠性:測序的樣本數(shù)越多,越能夠降低背景差異

檢測離群樣本:異常樣本的存在,會(huì)嚴(yán)重影響測序結(jié)果的準(zhǔn)確性,通過計(jì)算樣本間的相關(guān)性可以發(fā)現(xiàn)異常樣本,將其排除。

案例一:

轉(zhuǎn)錄組測序中生物學(xué)重復(fù)如何來設(shè)

注:COX4NBRASGRP1基因在生物學(xué)重復(fù)樣本中表達(dá)值的散點(diǎn)圖:

     左邊紅色,COX4NB基因表達(dá)值的散點(diǎn)圖

     右邊藍(lán)色,RASGRP1基因達(dá)值的散點(diǎn)圖 

     上面一行,測序數(shù)據(jù)的散點(diǎn)圖 

     下面一行:芯片數(shù)據(jù)的散點(diǎn)圖

COX4NB在生物學(xué)重復(fù)樣本中表達(dá)差異非常??;但在同樣情況下,RASGRP1的生物學(xué)差異很大。結(jié)果意味著:不同實(shí)驗(yàn)組間 COX4NB的表達(dá)水平的變化存在研究意義;而同樣情況下RASGRP1的檢測數(shù)據(jù)可能不能說明問題。

由此可知,設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)如果沒有生物學(xué)重復(fù),或者生物學(xué)重復(fù)的數(shù)量不夠,就不能得到有統(tǒng)計(jì)意義的實(shí)驗(yàn)結(jié)果;獲得的差異表達(dá)的基因很可能僅僅是少數(shù)個(gè)體差異的表現(xiàn),并不能反映疾病或者某種特定生理狀態(tài)的群體本質(zhì)特征。

3.生物學(xué)重復(fù)設(shè)置幾個(gè)合適?

您是不是有同樣的問題:轉(zhuǎn)錄組測序是否必須進(jìn)行生物學(xué)重復(fù)啊,是否要3個(gè)重復(fù),是否可以用3個(gè)樣品的RNA等量混合代替生物學(xué)重復(fù),如果不重復(fù)能否發(fā)文章…..?一方面是有限的經(jīng)費(fèi),一方面是編輯的質(zhì)疑;實(shí)在很難抉擇呀~~~

目前沒有生物學(xué)重復(fù)的實(shí)驗(yàn)發(fā)文章比較困難,尤其是IF≥5的雜志。如果確實(shí)受限于研究經(jīng)費(fèi),無法設(shè)置生物學(xué)重復(fù)。文章投出之后,遭編輯質(zhì)疑。那就得結(jié)合強(qiáng)有力的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)做支撐,比如定量實(shí)驗(yàn),F(xiàn)ISH熒光原位雜交,或者是northern 雜交等,用實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)說服編輯。重復(fù)設(shè)置原則上越多越好,然而考慮到現(xiàn)實(shí)條件,重復(fù)設(shè)置≥3。一般不建議設(shè)置兩個(gè)重復(fù),因?yàn)槿绻麅烧呓Y(jié)果不一致,我們無法確定以哪個(gè)數(shù)據(jù)為參考。

注:3個(gè)生物學(xué)重復(fù),不等同于將3個(gè)樣品的RNA等量混合后測序。3個(gè)樣品等量混合測序,相當(dāng)于將3個(gè)樣本的基因表達(dá)量取了平均值,其實(shí)就是相當(dāng)于取了一個(gè)樣本,由此得到的差異基因同樣不可信,不能反應(yīng)群體生物學(xué)現(xiàn)象。

4.生物學(xué)重復(fù)分析結(jié)果展示

以公司做項(xiàng)目的經(jīng)驗(yàn)來看,原核生物以及真菌生物學(xué)重復(fù)的效果>植物>動(dòng)物,這是由于動(dòng)植物個(gè)體差異較大所導(dǎo)致。所以動(dòng)植物在選取生物學(xué)重復(fù)時(shí),應(yīng)按照嚴(yán)格的篩選條件進(jìn)行取樣,方可得到理想結(jié)果。

案例二:真菌的轉(zhuǎn)錄組測序

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì):處理組與對照組(n=3)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果:如下圖所示,重復(fù)樣本間的相關(guān)系數(shù)r>0.9

轉(zhuǎn)錄組測序中生物學(xué)重復(fù)如何來設(shè)

案例三:植物轉(zhuǎn)錄組測序

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì):處理組與對照組(n=3)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果:分析發(fā)現(xiàn)有一組樣品明顯偏離其余兩組樣品,確定是樣品問題后,將其去除,得到兩重復(fù)樣本間的相關(guān)系數(shù)r>0.95

轉(zhuǎn)錄組測序中生物學(xué)重復(fù)如何來設(shè)

5.生物學(xué)重復(fù)取樣要求:

     不是任意選取幾組樣品都能做為生物學(xué)重復(fù)樣本,尤其是動(dòng)植物個(gè)體,由于個(gè)體差異大, 在選取生物學(xué)重復(fù)樣本時(shí),應(yīng)嚴(yán)格控制變量。

  植物取樣:同一片試驗(yàn)田,同一長勢,外部形態(tài)特征相同

  動(dòng)物取樣:同一遺傳背景,同一飼養(yǎng)條件,同一年齡,性別相同,外部形態(tài)特征相同 

  混合取樣:保證混合樣品處理方式相同,處于同一發(fā)育階段,個(gè)體外部形態(tài)特征相同

參考文獻(xiàn):

1. Sequencing technology does not eliminate biological variability. Kasper D Hansen,Zhijin Wu, Rafael A Irizarry & Jeffrey T Leek. Nat Biotechnol., 2011. 29(7):572–573.

2. The Power of Replicates-Illumina

3. Statistical Design and Analysis of RNA Sequencing Data.Paul L.Auer and R.W. Doerge. Genetics.

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