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介紹 醫(yī)學(xué)和科學(xué)團體對于細胞來源的亞微米級微粒，即所謂的胞外囊泡（EV）有很大的研究興趣。但是，該領(lǐng)域存在的困難在于如何對測定這些小微粒的技術(shù)進行優(yōu)化和標準化。盡管已經(jīng)開發(fā)出了競爭性的技術(shù)，但是，對于生命科學(xué)研究者而言，流式細胞術(shù)是一種很方便的研究方法。分析中需要解決的問題是如何能準確測定小微粒的大小特征；尤其是在僅考慮散射特性時。傳統(tǒng)上，流式細胞分析儀旨在執(zhí)行全血分析，因此，測定的細胞大小在 3μm 以上。被檢出的低于3μm“臨界值”的微粒被視為細胞碎片。由于顯微鏡技術(shù)進步以及識別和表征分析低于1μm 細胞微粒的能力，雖然已經(jīng)開發(fā)出了可提高流式細胞分析儀散射參數(shù)的硬件，可用于檢測粒徑在<200nm-1μm>之間的微米級微粒群，但是，由于可重復(fù)性不夠，因此這些測定值的準確度以及檢測結(jié)果的有效性通常會受到質(zhì)疑。在本研究中，將在貝克曼庫爾特公司的 CytoFLEX 流式細胞儀檢測平臺上，考察以往定義EV 檢測范圍所使用的方法。 作者： 所屬機構(gòu)： 已申請專利保護的光學(xué)設(shè)計包括集成式光流單元和光電二極管檢測系統(tǒng)。此外，還對所有激光進行了集成，以取得最佳的激發(fā)效果。發(fā)出的光被引導(dǎo)進入專用的光纖陣列中，以使光損失達到最小，并使靈敏度達到最大。
CytoFLEX 不使用PMT，更準確地說，CytoFLEX 是第一臺將光電二極管用于熒光通道檢測的商用流式細胞儀。 已申請專利保護的波長分割多路轉(zhuǎn)換器（WDM）檢測模塊使用了固態(tài)、高效率、低噪聲光線陣列光電二極管檢測器（FAPD），可為您提供無與倫比的分辨率，能得出更為精密的數(shù)據(jù)，并能更好檢測罕見的陽性微粒。 光纖陣列光電二極管 (FAPD) 擁有低噪、高量子效率、光損失最少的優(yōu)點，同時，還能夠確保高信噪比和最優(yōu)光學(xué)分辨率，尤其是在微小顆粒測定和弱熒光探測領(lǐng)域。這項技術(shù)源自光纖光學(xué)通訊行業(yè)，最初被稱為“ 波分復(fù)用 (Wavelength Division Multiplexing)”， 或者簡稱為 WDM。CytoFLEX檢測模塊通過高效光纖耦合收集來自各條光路的發(fā)射光。 每根光纖將對應(yīng)的激光激發(fā)的發(fā)射光傳遞到特定波長的WDM 的檢測模塊。在WDM 模塊內(nèi)，熒光將被分割，并通過一系列帶通濾光片和集成式光學(xué)系統(tǒng)，被緊密聚焦在超低噪聲硅光電檢測器陣列上面。使用帶通濾片全反射收集光信號，提高檢測能力，使所有通道的靈敏度保持一致性。 0.19μm、0.52μm 和0.78μm Dragon Green 微球獲自Bangs Laboratories, Inc 公司。Dragon Green 是一種極佳的波譜分析熒光素代用品（488nm/530nm），并適合于與熒光素濾光片裝置配套使用。許多成像應(yīng)用依賴熒光微球來檢測結(jié)合的陽性微?；蛐盘栐鰪姟？赏ㄟ^不同的熒光強度來構(gòu)建的微球群，以便開發(fā)多路熒光流式細胞檢測試驗，小的熒光微球可用作ELISA 類型的試驗的報告分子。熒光微球還可用于液體示蹤、細胞示蹤和細胞吞噬作用研究。
本項目使用了內(nèi)部標記的Dragon Green 熒光微球。使用溶劑溶脹/ 染料- 截留技術(shù)，通過內(nèi)部方法對熒光微球進行染色。內(nèi)部染色方法效果良好，能產(chǎn)生穩(wěn)定的微粒，一般情況下，其熒光CV 范圍很窄。通過該方法，表面仍有基團可用于將配基（蛋白質(zhì)、抗體、核酸等）偶聯(lián)在微球的表面上，這對于分析物檢測和免疫分析應(yīng)用很重要。內(nèi)部染色的微球也廣泛用于成像應(yīng)用，因其對光褪色作用有較大的抵抗力。
對于本流式細胞檢測試驗，選擇了既往列明粒徑的Dragon 微球，用于后續(xù)的細胞追蹤。通過使用不同粒徑的微球和熒光強度，研究人員可對執(zhí)行細胞分析的流式細胞儀進行優(yōu)化。
選擇的微球粒徑與待分析的細胞粒徑相似。因此，對Dragon Green 微球使用的所有電壓、增益和臨界設(shè)置進行了優(yōu)化，以建立相對粒徑分布矩陣。已通過對微球進行連續(xù)稀釋，并隨后在貝克曼庫爾特公司的“MoFlo Astrios EQ”、“MoFlo XDP”（帶有Propel Labs NanoView 配件）以及Gallios 流式細胞儀上進行檢測，確定微球濃度。 設(shè)門與分析 應(yīng)用了Dragon 微球粒徑分布測試方案， 以評價CytoFLEX 流式細胞儀檢測EV 的能力。對散射性能進行分析，以確定實現(xiàn) EV 分析的最高效參數(shù)。CytoFLEX 流式細胞儀能夠通過紫色（405nm）側(cè)散射光（VSSC）進行觸發(fā)和分析。為達本研究之目的，將使用VSSC。根據(jù)既往進行的研究，如果沒有提高FSC 參數(shù)（PMT 或光角度調(diào)整）的硬件，則無法測定粒徑低于0.5μm 的微粒（圖1）。
通過使用VSSC 參數(shù)，低于500nm 的Dragon 綠色微粒將能被看見和區(qū)分，因為理論上認為，較低的激光波長能夠檢測較小粒徑的微粒。此外，通過軟件界面，能很容易控制CytoFLEX 鞘液傳輸。直觀的軟件控制允許用戶手工控制樣本速度，以便在較低的μL/min 流速水平上，使激光激發(fā)效率達到最大。還能提高流體動力學(xué)聚焦，以限制微粒聚叢的能力。制備濾過的PBS 儲備液（加有0.1% Tween-20）。使用PBS/0.1% Tween-20 溶液， 對0. 52、0.78 和0.19μm 的微球進行稀釋，使其終濃度達到1.29*107個微球/mL。
稀釋前，對Dragon Green 微球進行超聲波處理，以消除聚集體。
在貝克曼庫爾特 CytoFLEX 流式細胞儀上，運行以下樣本，以優(yōu)化儀器：
優(yōu)化后的設(shè)置
通過使用Dragon Green 微球的熒光特點，可使用根據(jù)熒光強度確認的粒徑分布來保證數(shù)據(jù)質(zhì)量。
此外，還獲取了一份PBS 儲備液樣本的數(shù)據(jù)，以分析PBS 背景信號。很容易將所有三種微球群與背景和微粒彼此之間分開。 所有樣本均使用CytExpert* 或Kaluza* 軟件進行分析。如前面的分析圖所示，對三種不同粒徑的Dragon 微球進行了識別、設(shè)門，三種微球彼此之間可以相互區(qū)分，并能與背景區(qū)分開。對設(shè)置進行了優(yōu)化并保存，以便用于后續(xù)的細胞檢測應(yīng)用。由于該方法能夠識別并容易區(qū)分Dragon 微球群（根據(jù)粒徑），因此對EV 的設(shè)置進行了優(yōu)化和標準化 注意 本應(yīng)用說明書中顯示的結(jié)果僅代表在貝克曼庫爾特CytoFLEX 流式細胞儀上產(chǎn)生的結(jié)果。由于不同分析儀之間存在性能差異，因此，作者不能保證使用其他的流式細胞儀可得到相似的結(jié)果 圖1：傳統(tǒng)流式細胞儀的動力學(xué)范圍。將488nm SSC 的臨界值設(shè)置為最低的可能設(shè)置。 上表顯示了CytoFLEX 流式細胞儀上SSC 和VSSC 兩種方法之間的差異。實際的MFI 均一致，但VSSC 的增益值比SSC 的增益值低得多。
* 以上所提及產(chǎn)品僅用于科學(xué)研究，不用于臨床診斷。 |
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