基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究揭示了人類腫瘤主要的驅(qū)動突變，異常調(diào)節(jié)程序和疾病亞型。然而，這些研究依賴于大量測量腫瘤的分析技術(shù)，限制了其捕獲腫瘤內(nèi)異質(zhì)性的能力。大量的證據(jù)表明惡性和非惡性細胞之間的腫瘤內(nèi)異質(zhì)性及其在腫瘤微環(huán)境（TME）內(nèi)的相互作用對腫瘤生物學(xué)的各個方面是關(guān)鍵的。單細胞基因組學(xué)的最新進展提供了探索細胞分辨率的遺傳和功能異質(zhì)性的途徑。人類腫瘤，循環(huán)腫瘤細胞（CTC）和患者來源的異種移植物的單細胞RNA測序（scRNAseq）研究揭示了對腫瘤組成，癌癥干細胞和耐藥性的新觀點。然而，盡管上皮腫瘤占優(yōu)勢，scRNAseq研究并沒有深入地表征它們。在這些腫瘤中，向引流淋巴結(jié)（局部轉(zhuǎn)移）和其他器官（遠處轉(zhuǎn)移）的轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致高發(fā)病率和死亡率的主要原因。轉(zhuǎn)移瘤常常是根據(jù)原發(fā)腫瘤的分子和病理特征進行治療的，由此提出了它們是否具有相同的遺傳學(xué)，表觀遺傳學(xué)和脆弱性的問題。然而，原發(fā)性腫瘤和轉(zhuǎn)移瘤的潛在不同組成阻礙了大塊腫瘤組織的直接比較。原則上，單細胞表達譜分析研究將提供令人信服的選擇。 

頭頸部鱗狀細胞癌（HNSCC）是一種與酒精和煙草暴露密切相關(guān)的具有異質(zhì)性的上皮腫瘤?；颊咄谕砥诔霈F(xiàn)的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（LN），凸顯轉(zhuǎn)移仍然是一個核心挑戰(zhàn)。在這里，研究者研究原發(fā)性頭頸部鱗狀細胞癌和匹配的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，以更好地了解瘤內(nèi)異質(zhì)性，侵襲和轉(zhuǎn)移。來自18位患者的rv6000細胞的轉(zhuǎn)錄譜揭示了區(qū)分不同惡性，間質(zhì)和免疫細胞的表達機制。惡性細胞在細胞周期，壓力，缺氧和上皮分化過程中表達有所不同。一部分細胞也表達了部分EMT（p-EMT）程序與細胞外基質(zhì)蛋白，但缺乏經(jīng)典的EMT轉(zhuǎn)錄因子（TFs）。p-EMT細胞被定位于原發(fā)癌的邊緣，其中原發(fā)癌和“癌相關(guān)成纖維細胞”（CAF）也鄰近。研究者利用HNSCC生態(tài)系統(tǒng)的知識來重新評估來自癌癥基因組圖譜（TCGA）的大量RNA-seq數(shù)據(jù)。這為HNSCC表達亞型的相關(guān)研究提供了新見解和思路，并將p-EMT程序建立為不良臨床特征（包括侵襲和轉(zhuǎn)移）的獨立預(yù)測因子。

圖1 頭頸鱗癌單細胞RNA測序表征瘤內(nèi)表達異質(zhì)性

樣本選擇：

• 600個來自HNSCC樣本的單細胞

• 5個HNSCC細胞系

HNSCC原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移瘤的單細胞表達圖譜

為了探索HNSCC腫瘤的細胞多樣性，研究者關(guān)注了HNSCC最常見的亞型：口腔腫瘤。研究者為來自18名未接受治療的患者的原發(fā)性腫瘤進行scRNA-seq獲取表達譜，并對其中五名患者的LN轉(zhuǎn)移執(zhí)行同樣的操作。研究者還獲得了這些腫瘤的全外顯子組測序（WES）和靶向基因分型（SNaPshot）數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)顯示了一系列可能的驅(qū)動突變和染色體變異，與已建立的HNSCC基因組特征保持了一致。

在最初的質(zhì)量控制后，研究者保留了來自18名患者的5,902個細胞的單細胞轉(zhuǎn)錄組。研究者自信地通過三種補充方法來區(qū)分2215個惡性細胞和3363個非惡性細胞。首先，研究者根據(jù)跨染色體間隔的平均表達譜推斷每個單細胞中的大規(guī)模染色體拷貝數(shù)變異（CNV）。這些推斷的CNVs與WES一致，通過推斷的CNVs將惡性細胞從正常核型的非惡性細胞中分離出來。其次，研究者通過其上皮來源鑒別惡性細胞，其不同于TME中的基質(zhì)和免疫細胞。研究者發(fā)現(xiàn)在具有上皮標(biāo)志物表達的細胞和具有異常核型的細胞之間具有顯著的一致性。最后，研究者通過它們的全局表達模式將細胞劃分到初始簇?；?/span>CNV和上皮標(biāo)志物分析，絕大多數(shù)細胞均被分到具有一致惡性或非惡性分類簇中去。

頭頸部癌癥的表達異質(zhì)性景觀

非惡性細胞的單細胞概況揭示了腫瘤微環(huán)境（TME）的組成。研究者通過它們的表達狀態(tài)將3,363個非惡性細胞分成八個主要簇。根據(jù)已知標(biāo)記基因的表達，對B細胞，巨噬細胞，樹突狀細胞，肥大細胞，內(nèi)皮細胞，成纖維細胞和肌細胞這八個簇進行注釋。值得注意的是，每個簇含有來自不同患者的細胞，表明TME中的細胞類型和表達狀態(tài)在HNSCC腫瘤中基本一致，并且不代表患者特異性亞群或批處理效應(yīng)，盡管它們的比例是不同的。由于研究者的數(shù)據(jù)集中T細胞和成纖維細胞數(shù)量相對較多，研究者通過更精確的聚類發(fā)現(xiàn)了T細胞和成纖維細胞的多樣性。主要T細胞簇（rv1000個T細胞）可以分為四個亞群，研究者注釋為調(diào)節(jié)性T細胞（Treg），常規(guī)CD4 + T輔助細胞（CD4 + Tconv）和兩種細胞毒性CD8 + T細胞群（CD8 + T和CD8 + Texhausted）。細胞毒素亞型在共抑制性受體（例如PD1，CTLA4）和與T細胞功能障礙和衰竭相關(guān)的其他基因的表達方面不同，并由此定義HNSCC中推定的T細胞耗竭程序。耗竭CD8 + T細胞的部分在研究者的隊列患者中顯著變化。這些T細胞表達狀態(tài)可以為理解和預(yù)測檢查點免疫療法的反應(yīng)提供幫助。

盡管研究人員對人類腫瘤中成纖維細胞有很大的興趣，但其調(diào)節(jié)狀態(tài)仍不清楚。 rv1,500成纖維細胞分成兩個主要子集，一個第三次要子集。一個子集表達肌成纖維細胞的經(jīng)典標(biāo)記，包括α平滑肌肌動蛋白（ACTA2）和肌球蛋白輕鏈蛋白（MYLK，MYL9）。肌成纖維細胞是TME的成熟組分，并與傷口愈合和攣縮有關(guān)。第二個子集表達與CAF相關(guān)的受體，配體和細胞外基質(zhì)（ECM）基因，包括成纖維細胞活化蛋白（FAP），podoplanin（PDPN）和結(jié)締組織生長因子（CTGF）。第三個子集基本不包括肌成纖維細胞和CAF的標(biāo)記物，并可能代表處于靜止?fàn)顟B(tài)的成纖維細胞。這些不同的成纖維細胞表達狀態(tài)在腫瘤中可重現(xiàn)地被檢測到，并因此可代表HNSCC TME的共同特征。

盡管CAF的細胞特征和起源已被歸于各種譜系，但是研究者檢測到的亞群與成纖維細胞特征高度一致。進一步的分析將CAFs（第二個子集）分為具有立即早期應(yīng)答基因（例如JUN，F(xiàn)OS），間充質(zhì)標(biāo)志物（例如VIM，THY1），配體和受體（例如FGF7）差異表達的兩種類型（CAF1和CAF2），TGFBR2 / 3）和ECM蛋白質(zhì)（例如MMP11，CAV1）。這種瘤內(nèi)CAF異質(zhì)性與TMF中涉及復(fù)雜結(jié)構(gòu)和旁分泌相互作用的觀點一致。

與非惡性細胞相比，2215惡性細胞根據(jù)其起源的腫瘤聚類。超過2000個基因優(yōu)先在個體腫瘤中表達。差異表達的基因在腫瘤之間不同的CNV內(nèi)富集。其他差異與腫瘤亞型有關(guān)（參見以下通過大量表達數(shù)據(jù)解卷積精制的HNSCC亞型）。例如，在研究者的隊列中，與解毒和藥物代謝有關(guān)的基因（例如，GPX2，GSTM，CYP，ABCC1）優(yōu)先由兩種經(jīng)典亞型腫瘤表達。最后，其他差異表達的基因與應(yīng)激（例如JUNB，F(xiàn)OSL1）或免疫激活（例如IDO1，STAT1，TNF）有關(guān)，可能對不同的TME有反應(yīng)。因此，腫瘤間惡性細胞表達異質(zhì)性反映了研究者隊列中腫瘤之間遺傳學(xué)，亞型和TME的差異。

惡性腫瘤瘤內(nèi)表達的異質(zhì)性

接下來研究者探討了同一腫瘤內(nèi)不同惡性細胞之間的表達狀態(tài)如何變化，重點討論獲得惡性細胞轉(zhuǎn)錄組最多數(shù)量的10對腫瘤樣本。研究者使用非負(fù)矩陣分解來揭示在惡性細胞亞群中得到優(yōu)先共同表達的一系列基因。例如，對于MEEI25惡性細胞，研究者定義了6個不同的基因特征。對10個腫瘤樣本中的每一個都應(yīng)用該方法，共定義了60個基因特征。接下來，研究者使用層次聚類來將這些60個特征提取成元特征，這些元特征反映了在多個腫瘤內(nèi)變化的常見表達程序。來自不同腫瘤的特征之間的高一致性表明它們反映了腫瘤內(nèi)表達異質(zhì)性的共同模式。

圖2  頭頸鱗癌生態(tài)系統(tǒng)中惡性細胞和非惡性細胞的表達異質(zhì)性

在至少兩個腫瘤中，七個表達程序優(yōu)先由惡性細胞亞群表達。兩個程序反映了細胞周期的G1 / S和G2 / M期，并在每個腫瘤中鑒別出周期細胞（不同腫瘤中14％-40％的細胞）。第三個程序包括JUN，F(xiàn)OS，以及涉及細胞激活和應(yīng)激反應(yīng)的早期基因。第四個程序富含缺氧反應(yīng)相關(guān)基因，并且在缺氧條件下培養(yǎng)的HNSCC細胞中數(shù)量增加。

另外兩個程序主要由上皮基因組成，如EPCAM，細胞角蛋白（例如KRT6,16,17，75）和激肽釋放酶（KLK5-11）。雖然所有的惡性細胞都表達上皮標(biāo)記物，其中許多在惡性細胞中大部分是均一的，但這些特定上皮基因的表達在惡性細胞中是不同的，并且可能反映了上皮分化程度。最終的表達程序包含與ECM相關(guān)的基因，并具有EMT的特征。這個程序在所檢查的10個腫瘤中的7個細胞亞群中是明顯的。

HNSCC中的p-EMT程序

盡管EMT程序被廣泛認(rèn)為是耐藥，侵襲和轉(zhuǎn)移的潛在驅(qū)動因素，但它們在人類體內(nèi)上皮腫瘤中的模式和意義仍不清楚。因此，研究者仔細檢查了ECM計劃中EMT的特征。除ECM基因如基質(zhì)金屬蛋白酶，層粘連蛋白和整聯(lián)蛋白外，該程序還包括EMT標(biāo)志物波形蛋白（VIM）和整聯(lián)蛋白α-5（ITGA5）。此外，該方案中得分最高的基因之一是轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-b誘導(dǎo)（TGFBI），暗示經(jīng)典的EMT調(diào)節(jié)劑TGF-b。

圖3  HNSCC中的p-EMT程序

雖然該程序具有經(jīng)典EMT的關(guān)鍵特征，但缺乏其他標(biāo)志。首先，雖然特征伴隨著某些上皮基因的表達降低，但是上皮標(biāo)記物的總體表達還是明顯地保持下來。其次，研究者沒有檢測到經(jīng)典EMT TF，ZEB1 / 2，TWIST1 / 2和SNAIL1的表達。只有SNAIL2被檢測到（在70％的HNSCC細胞中），盡管其表達與腫瘤的程序相關(guān)，但與腫瘤內(nèi)個體細胞的程序并不相關(guān)。最近的研究表明SNAIL2比其他EMT TFs早。 SNAIL2也涉及傷口愈合中的p-EMT應(yīng)答。研究者注意到，EMT越來越被認(rèn)為是一個連續(xù)和變化的過程。因此，研究者建議這里確定的體內(nèi)程序反映了一個EMT的部分狀態(tài)或p-EMT。幾個額外的分析表明，這個p-EMT程序不同于源自細胞系和腫瘤模型的完整EMT程序，以及源自腫瘤的腫瘤譜間充質(zhì)特征。

體外p-EMT細胞是動態(tài)的和侵入性的

研究者研究了5個HNSCC細胞系中p-EMT程序的功能意義。501個細胞的表達譜與人類腫瘤大不相同。然而，SCC9細胞的一個子集（口腔來源的細胞系）中的一部分包含了體內(nèi)p-EMT程序。當(dāng)通過流式細胞術(shù)分離這些高p-EMT細胞時，它們呈現(xiàn)出增強的侵襲性。它們的增殖速率也降低，與患者樣本的scRNA-seq分析及之前的EMT研究一致。

先前的研究表明EMT的早期階段可能是過渡性的或亞穩(wěn)態(tài)的。因此，研究者猜想更多上皮細胞亞群中，p-EMT是否可以在動態(tài)平衡中，反映出瞬態(tài)狀態(tài)。為了測試這個，研究者將來自SCC9的高p-EMT和低p-EMT細胞分類，培養(yǎng)它們，并重新評估標(biāo)記物表達。兩個群體在分選后4和24小時仍保持不同（t檢驗，p <>

 p-EMT細胞定位于靠近CAF的前沿

綜上所述，研究者的體內(nèi)圖譜和體外功能數(shù)據(jù)表明，p-EMT程序是動態(tài)的，侵入性的，并且可能對TME提示有響應(yīng)。這導(dǎo)致研究者進一步探究HNSCC腫瘤內(nèi)表達該程序的細胞的原位空間定位。研究者使用免疫組織化學(xué)染色在p-EMT程序（PDPN，LAMC2，LAMB3，MMP10，TGFBI和ITGA5）中的頂部基因的腫瘤集合，以及HNSCC標(biāo)記物p63。這些實驗揭示了一組惡性細胞共同染色的p-EMT標(biāo)記物，并定位到與周圍基質(zhì)緊密貼合的腫瘤的前緣。缺乏每個scRNA-seq的p-EMT程序的腫瘤不染色這些標(biāo)記物。相反，上皮分化標(biāo)志物（SPRR1B，CLDN4）在腫瘤的核心染色了一組不同的細胞，這與scRNA-seq數(shù)據(jù)中這些程序之間的負(fù)相關(guān)性一致。

圖4  p-EMT細胞定位于靠近CAF的前沿

將p-EMT程序定位于前沿促使研究者考慮其與TME的相互作用，如配體受體信號傳導(dǎo)。研究者推測基于一種細胞類型的配體和另一種細胞類型的相應(yīng)受體的表達推定的腫瘤-基質(zhì)相互作用。這個預(yù)測的“外向”信號以相似的比例從惡性細胞向各種TME細胞類型發(fā)出信號。相反，當(dāng)研究者考慮對惡性細胞“傳入”信號時，研究者發(fā)現(xiàn)CAFs表達顯著更高數(shù)量的對應(yīng)于受惡性細胞表達的受體的配體（超幾何測試，p <>

為了評估配體-受體相互作用的功能意義，研究者用TGF-b處理SCC9細胞。暴露4小時誘導(dǎo)了類似p-EMT的程序，其在抑制TGF-β時被抑制（t檢驗，p <10-16;）。 tgf-b處理也增加了侵襲性并減少了增殖，而抑制作用具有相反的效果（anova，p=""><0.0001）。此外，tgfbi（tgf-β的已知靶標(biāo)）和頂級p-emt基因的過度表達導(dǎo)致對侵襲和增殖的相似作用（t檢驗，p><0.005和anova，p><0.0001）。相反，tgfbi的遺傳失活消除了tgf-β應(yīng)答（anova，p><>

 腫瘤內(nèi)HNSCC異質(zhì)性在局部轉(zhuǎn)移中的研究進展

為了進一步了解潛在的HNSCC擴散的決定因素，研究者將LN轉(zhuǎn)移與原發(fā)性腫瘤進行了比較。盡管WES和推測的CNV顯示了原發(fā)性和匹配的LN樣本之間的存在一些基因組差異，但是可能是由于所研究的個體數(shù)量較少，他們沒有鑒別出任何一致的區(qū)別。

圖5  腫瘤內(nèi)HNSCC異質(zhì)性在局部轉(zhuǎn)移中的研究進展

LN中惡性細胞的表達譜也與相應(yīng)的原發(fā)腫瘤大致匹配。在每個配對樣本中，都有較少的差異表達基因是顯著差異的，但是它們在整個群體（cohort）中不一致。盡管在不同部位的p-EMT高低亞群發(fā)生率不同，但所有患者的原發(fā)腫瘤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中p-EMT高低亞群的存在是一致的。這些發(fā)現(xiàn)提升了LN轉(zhuǎn)移所需的程序是動態(tài)的可能性，解釋了在原發(fā)性腫瘤和LN的比較中未被發(fā)現(xiàn)的可能原因。實際上，之前的研究也未能檢測到腫瘤和局部轉(zhuǎn)移灶之間的基因?qū)用婊蜣D(zhuǎn)錄層面的區(qū)別。

研究者還觀察到淋巴結(jié)和原發(fā)性腫瘤間質(zhì)和免疫細胞的特征和表現(xiàn)的總體一致性，雖然有一些重要的區(qū)別。大多數(shù)簇含有來自兩個位點的細胞，但僅在原發(fā)性腫瘤中觀察到了肌細胞，并且僅在LN中發(fā)現(xiàn)了B /漿細胞。成纖維細胞亞型也不同地表示：LN成纖維細胞富含肌成纖維細胞和CAF1亞型（超幾何檢驗; p <>

這些發(fā)現(xiàn)促使研究者使用上述標(biāo)記物檢查LN標(biāo)本的組織學(xué)形態(tài)。研究者發(fā)現(xiàn)大部分完整的上皮結(jié)構(gòu)或惡性細胞的“巢”，在其外圍具有p-EMT標(biāo)記，被CAF和其他TME組分包圍。這些觀察結(jié)果與“集體遷移”模型一致，惡性細胞和基質(zhì)細胞以團簇形式移動，淋巴源性擴散并形成LN轉(zhuǎn)移灶。或者，單個細胞可能在團簇移動的同一部位播散和植入（“單細胞播散”），從而在LN轉(zhuǎn)移瘤內(nèi)重現(xiàn)原發(fā)腫瘤的異質(zhì)性。

通過大量表達數(shù)據(jù)去卷積改良的HNSCC亞型分型

研究者接下來考慮了從scRNA-seq數(shù)據(jù)鑒定的惡性和間質(zhì)表達程序的一般性和預(yù)后意義。最近的TCGA研究分析了數(shù)百個HNSCC腫瘤的表達譜，并將它們分為四個亞型：基礎(chǔ)型，間充質(zhì)型，經(jīng)典型和非典型型。盡管TCGA分型是從大量腫瘤細胞中獲取的，但研究者推斷單個細胞組分的表達程序可能使研究者能夠提取更多的了解。具體而言，研究者從這些批量數(shù)據(jù)中定義的分子亞型判斷是否能夠反映惡性程序，惡性細胞組成和/或TME組成的差異。

圖6  通過大量表達數(shù)據(jù)去卷積改良的HNSCC亞型分型

研究者首先確定了十個HNSCC腫瘤的TCGA表達亞型。研究者評估了每個腫瘤的惡性細胞與其亞型表達特征的對應(yīng)關(guān)系。引人注目的是，每個腫瘤清楚地映射到三個亞型之一：基本型（n = 7），經(jīng)典型（n = 2），或非典型（n = 1）。沒有一個惡性細胞映射到間充質(zhì)亞型，即使它是口腔腫瘤中第二常見的亞型。然而，當(dāng)研究者增大分析樣本數(shù)目，當(dāng)樣本中包括基質(zhì)和免疫細胞時，發(fā)現(xiàn)數(shù)百CAFs、肌成纖維細胞和肌細胞映射到間充質(zhì)亞型。這一發(fā)現(xiàn)提出了一種可能性，即TCGA間充質(zhì)亞型反映大批量樣品中的高基質(zhì)表現(xiàn)而不是獨特的惡性細胞程序。實際上，TCGA樣品的分析鑒定到間充質(zhì)亞型腫瘤高度表達對CAF和肌細胞特異性的基因。此外，當(dāng)研究者檢查TCGA的HNSCC腫瘤的組織學(xué)切片時，鑒定到間充質(zhì)腫瘤的成纖維細胞比基礎(chǔ)型腫瘤多大約2.7倍（t檢驗，p <>

為了進一步研究TME組分對TCGA分類的影響，研究者設(shè)計了計算方法從TCGA分布中減去非惡性細胞的影響。研究者限制對惡性細胞表達的基因的分析。由于這些基因大多數(shù)也是由非惡性細胞表達的，研究者將它們的表達歸一化以消除非惡性細胞的預(yù)期貢獻。為此，研究者使用細胞類型特異性基因標(biāo)簽來估計每種腫瘤中每種細胞類型的相對豐度，然后，對于每種基因，研究者推斷其在腫瘤中的大量表達與相對豐度之間的線性關(guān)系每個細胞類型使用多重線性回歸。通過使用此回歸模型的殘差，消除了細胞類型頻率（包括惡性細胞頻率（即純度））的影響，并且推斷了每種TCGA腫瘤的惡性細胞特異性內(nèi)在表達譜。

值得注意的是，雖然TCGA數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)分析恢復(fù)了所有四個亞型，推斷的惡性細胞特異性表達的分析消除了間充質(zhì)亞型，同時維持其他三個亞型。先前被歸類為間充質(zhì)的腫瘤被發(fā)現(xiàn)是先前描述的基底亞型（現(xiàn)稱為“惡性基底”）的一部分。研究者驗證了TCGA間充質(zhì)評分反映了主要由CAF表達的基因，并且不與惡性細胞特異性p-EMT程序相關(guān)。因此，研究者建議可以將HNSCC腫瘤細化為惡性細胞的三種亞型（惡性基底，典型和非典型），前述間充質(zhì)亞型反映具有較大基質(zhì)成分的惡性-基底腫瘤。合并的惡性-基礎(chǔ)亞型特別普遍，在TCGA中口腔腫瘤的占比> 70％，與研究者隊列中十個腫瘤中的七個的分類一致。

p-EMT預(yù)測轉(zhuǎn)移和不良病理學(xué)特征

納入TCGA數(shù)據(jù)使研究者有機會在更大的隊列中研究p-EMT程序的普遍性和重要性。在研究較小的樣本群體中，p-EMT程序在來自10個腫瘤中的7個的細胞中明顯，這與7個映射到惡性基底亞型的腫瘤完全對應(yīng)。與研究者較小的隊列一致，TCGA中惡性基底腫瘤中的p-EMT水平最高。此外，惡性基底TCGA腫瘤（而非非典型和經(jīng)典腫瘤）的主成分分析顯示前兩個成分與p-EMT基因的表達相關(guān)，并與上皮分化基因呈負(fù)相關(guān)。值得注意的是，從大量表達數(shù)據(jù)的這些無偏分析定義的p-EMT程序與研究者的scRNA-seq分析所定義的高度一致。他們獨立證實了除了SNAIL2之外的經(jīng)典EMT TFs的缺失，并進一步支持人腫瘤中的體內(nèi)p-EMT狀態(tài)。因此，通過控制TME組成的混雜效應(yīng)，研究者證明p-EMT程序表達的差異是HNSCC腫瘤中腫瘤間變異性的主要來源。

圖7  p-EMT預(yù)測轉(zhuǎn)移和不良病理學(xué)特征

HNSCC腫瘤的淋巴源性擴散形成LN轉(zhuǎn)移是疾病負(fù)擔(dān)和死亡率的主要來源。因此，口腔腫瘤的切除通常伴隨著頸部剝離，以除去第一群體排出LN，這是一種與患者發(fā)病相關(guān)的手術(shù)。具有不良預(yù)后特征的腫瘤，例如囊外延伸或淋巴血管浸潤，也需接受輔助治療。因此，研究者測試了體內(nèi)p-EMT標(biāo)記是否可以預(yù)測惡性基底腫瘤中不利的病理學(xué)特征或疾病結(jié)果。

研究者發(fā)現(xiàn)，高p-EMT評分與LN轉(zhuǎn)移的存在和數(shù)量以及更高的淋巴結(jié)分期有關(guān)（超幾何檢驗; p <0.05）。研究者還發(fā)現(xiàn)腫瘤分級較高的關(guān)聯(lián)，為低分化腫瘤的侵襲性提供解釋。高p-emt評分與不良病理學(xué)特征（包括囊外延伸和淋巴管浸潤）類似地相關(guān)，但缺乏可靠的生物標(biāo)志物。有趣的是，p-emt與原發(fā)腫瘤大小無關(guān)，提示與侵襲和轉(zhuǎn)移直接相關(guān)，而與腫瘤生長無關(guān)?？傮w而言，p-emt基因是具有這些臨床特征的最高相關(guān)基因之一，而諸如細胞周期或缺氧的其他程序幾乎沒有強相關(guān)性。相反，上皮分化程序與轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)，與研究者之前觀察到的p-emt與上皮分化之間的逆相關(guān)性一致。重要的是，p-emt計劃比tcga間葉計劃或常規(guī)emt特征更能預(yù)測淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和局部浸潤，這兩者主要反映caf的發(fā)生頻率。目前的臨床實踐依賴于不完美的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的預(yù)測因素，如腫瘤的厚度和大小，導(dǎo)致不必要的頸淋巴切除率很高（> 80％）。 p-EMT評分有助于預(yù)測淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，從而降低不必要的頸淋巴切除相關(guān)的患者發(fā)病率。

腫瘤內(nèi)異質(zhì)性是腫瘤學(xué)的主要挑戰(zhàn)。在新興的技術(shù)中，scRNA-seq有助于確定與腫瘤生物學(xué)，診斷和治療有關(guān)的發(fā)育等級，抗藥性程序和免疫滲透模式。在這里，研究者應(yīng)用這種方法來表征原發(fā)性HNSCC腫瘤和匹配的LN轉(zhuǎn)移瘤。研究者的分析突出了一個復(fù)雜的細胞生態(tài)系統(tǒng)與惡性和非惡性細胞之間的積極串?dāng)_和與轉(zhuǎn)移相關(guān)的體內(nèi)p-EMT程序。研究者的研究代表了了解包括大多數(shù)實體惡性腫瘤在內(nèi)的上皮腫瘤中腫瘤內(nèi)表達異質(zhì)性的重要步驟。研究者的主要發(fā)現(xiàn)是在體內(nèi)惡性細胞中鑒定p-EMT程序。該程序涉及某些間質(zhì)基因的上調(diào)和上皮程序的調(diào)節(jié)。盡管讓人想起類似EMT的過程，但是該程序缺乏被認(rèn)為驅(qū)動EMT的經(jīng)典TF，除了SNAIL2之外。 SNAIL2水平與腫瘤個體細胞中的p-EMT程序不相關(guān)，但與研究者的小群組和TCGA腫瘤中的跨腫瘤的p-EMT程序相關(guān)，這暗示了轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)。先前的研究已經(jīng)將SNAIL2與傷口愈合所需的類EMT變化聯(lián)系起來，提高了這種生理反應(yīng)被浸潤性腫瘤細胞選擇的可能性。

鑒于經(jīng)典的調(diào)控程序的缺乏，上皮標(biāo)記物的保留以及這種表達狀態(tài)可能的短暫性，研究者推測p-EMT程序代表了可轉(zhuǎn)移狀態(tài)，雖然該狀態(tài)和EMT的某些方面有一定的相似性，但在實際上卻是和EMT不盡相同。盡管研究者描述了一個孤立的類似EMT的程序，EMT的分子描述目前正在重新評估，越來越多的證據(jù)表明是一個連續(xù)的狀態(tài)。也假設(shè)一個動態(tài)的p-EMT狀態(tài)被賦予侵入性而不喪失腫瘤起始能力。目前尚不清楚在HNSCC中是否存在完整的EMT狀態(tài)，或者頻譜是否只擴展到p-EMT。無論如何，研究者對患者的體內(nèi)p-EMT樣程序的定義應(yīng)該指導(dǎo)這一過程的未來研究，因為它涉及人類癌癥和轉(zhuǎn)移。

幾個觀察結(jié)果表明，p-EMT程序可能會促進局部浸潤和LN轉(zhuǎn)移。首先，IHC分析清楚地表明該方案定位于原發(fā)性腫瘤的前沿，潛在地使細胞群體的集體移動成為可能。有趣的是，p-EMT細胞與周圍TME中的CAF緊密接近，這與配體受體分析支持這些群體之間的調(diào)控性交叉對話相一致。其次，高p-EMT HNSCC細胞體外侵襲性增加。第三，數(shù)百個HNSCC腫瘤的大規(guī)模表達譜的解卷積將p-EMT程序確定為強烈預(yù)測淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴血管浸潤和結(jié)外延伸的患者之間變異的主要來源。重要的是，盡管CAF豐度并不獨立預(yù)測淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和浸潤，但CAF評分高和p-EMT評分高的腫瘤轉(zhuǎn)移傾向特別高，符合協(xié)同效應(yīng)。這可能反映CAF和惡性細胞促進淋巴結(jié)疾病之間旁分泌信號的作用。

與此同時，其他的觀察也調(diào)節(jié)了研究者的結(jié)論。首先，研究者研究的一個重要的警告是只有十個腫瘤被深刻地表征。對更多腫瘤的進行分析可能揭示額外的基質(zhì)，免疫和惡性細胞狀態(tài)，可能包括進一步向間充質(zhì)狀態(tài)進展的惡性細胞。其次，經(jīng)典和非典型HNSCC腫瘤基本上沒有p-EMT計劃，但是它們的轉(zhuǎn)移速度相似。因此，p-EMT可能與某些亞型相關(guān)，但與其他亞型相關(guān)，可能解釋EMT在腫瘤生物學(xué)中的重要性。第三，盡管研究者的數(shù)據(jù)表明p-EMT狀態(tài)對CAF信號有反應(yīng)，但程序可能僅僅是由于腫瘤邊界被破壞而增加TME相互作用的功能，因此是相關(guān)但不是轉(zhuǎn)移的原因。需要進一步的研究來定義p-EMT和相應(yīng)的基質(zhì)相互作用驅(qū)動HNSCC轉(zhuǎn)移的確切機制。

亞型分類方案已被應(yīng)用于幾種腫瘤類型的“大宗”分析，不能有效地解析瘤內(nèi)異質(zhì)性。在這里，對HNSCC腫瘤中惡性，間質(zhì)和免疫細胞類型的表達狀態(tài)的了解使研究者能夠解卷積TCGA數(shù)據(jù)并推斷惡性細胞特異性表達譜。該分析提示間充質(zhì)亞型反映了TME，即腫瘤內(nèi)CAF和肌細胞的分?jǐn)?shù)。事實上，沒有惡性細胞被映射到TCGA描述的間充質(zhì)亞型。因此，間充質(zhì)亞型可能反映基質(zhì)組成，應(yīng)在未來的研究中重新評估。相比之下，研究者發(fā)現(xiàn)對其他三種HNSCC亞型（經(jīng)典，非典型，基礎(chǔ)）的強有力的支持。來自研究者每個腫瘤的惡性細胞專門映射到這些亞型之一?？刂芓ME時，這些亞型也保持穩(wěn)定。盡管如此，基質(zhì)組分提供正向預(yù)后的洞察力的潛力表明未來的分類系統(tǒng)可能最終需要將惡性和非惡性組分整合到腫瘤中。

總之，研究者的工作為HNSCC生物學(xué)特性和惡性細胞、基質(zhì)細胞和免疫細胞圖譜提供重要見解，并推斷這些細胞應(yīng)該與其他上皮惡性腫瘤相關(guān)。研究者從大量細胞混合的表達數(shù)據(jù)中推斷惡性細胞特異性特征的計算方法，改進了HNSCC亞型分型，并提供了可以從許多其他癌癥數(shù)據(jù)集提取信息的一般策略。最后，研究者對p-EMT程序的定義有助于將大量EMT數(shù)據(jù)與人類腫瘤的體內(nèi)生物學(xué)相關(guān)聯(lián)。雖然需要進一步的研究，但是這種p-EMT程序與不利的臨床特征的關(guān)聯(lián)可以指導(dǎo)未來的診斷策略和治療方法。

參考文獻：

[1] Sidharth V.Puram,ItayTirosh, et al. Single-Cell Transcriptomic Analysis of Primary and Metastatic Tumor Ecosystems in Head and Neck Cancer[J]. Cell, 2017,171(7): 1611-1624.