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縱使不知其為何物，但CRISPR的大名想必諸位也略有耳聞。CRISPR 是基因編輯的一種技術(shù)，何謂基因編輯？基因編輯可以在特定的基因組位置進(jìn)行DNA的插入，缺失，修飾及替換，其對于一些基因遺傳病的治療或者通過修改基因提高農(nóng)作物產(chǎn)量有重要意義。這也就是為什么Jinek等人在2012年證明可以在體外對靶DNA進(jìn)行特異性切割后，已經(jīng)有數(shù)千篇關(guān)于CRISPR的文章被發(fā)表。 CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat）序列是一種成簇的、規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列于1987年被發(fā)現(xiàn)。 那么這個(gè)技術(shù)也廣泛地在基金申請中得到應(yīng)用，尤其在疾病的臨床治療應(yīng)用方向。
CRISPR：敲除、沉默、激活應(yīng)用 CRISPR-Cas系統(tǒng)是一種RNA介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，存在于大約48%細(xì)菌和95%古細(xì)菌中，可提供序列特異性保護(hù)以抵抗外來的DNA甚至RNA，說白了就是病毒的DNA非法進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi)并且要侵占其基因組，細(xì)菌自然不愿意，就采用了一種防衛(wèi)機(jī)制將其殺死，當(dāng)然是正當(dāng)防衛(wèi)。 這個(gè)防衛(wèi)包含三個(gè)階段：（1）適應(yīng)性階段，直接重復(fù)序列（repeat）被易變的DNA序列間隔開組成CRISPR序列，此時(shí)的DNA序列稱為spacer。Cas蛋白切割外來DNA片段，外來DNA片段稱為protospacer，然后將其整合到CRISPR序列上，這時(shí)外來DNA片段更名為spacer；（2）表達(dá)階段，CRISPR序列經(jīng)過轉(zhuǎn)錄、切割成為成熟的crRNA；（3）干擾階段，crRNA招募Cas效應(yīng)蛋白復(fù)合物特異性切割病毒同源性DNA。整個(gè)過程有點(diǎn)類似慕容復(fù)的“以彼之道，還施彼身”，你用DNA對付我，我用你的DNA把你殺死。 如果想要了解今年CRISPR發(fā)展趨勢的同學(xué)，可以按圖索驥去檢索高分綜述，師兄以為你們備好彈藥。
談了這么多，回到題目，Cas酶有多種？我只聽過Cas9！接下來談一下CRISPR分級(jí)，Makarova KS等人在2015年根據(jù)crRNA招募效應(yīng)蛋白的組成將其分為兩級(jí)，1級(jí)CRISPR系統(tǒng)利用多個(gè)Cas蛋白與crRNA形成效應(yīng)復(fù)合物，2級(jí)CRISPR系統(tǒng)利用單個(gè)大Cas蛋白與crRNA形成效應(yīng)復(fù)合物。自然組成越簡單越可以獲得更大的應(yīng)用。那Cas9與Cpf1選擇哪個(gè)更好呢？ Cas（CRISPR-associated protein）：CRISPR相關(guān)蛋白，是一種核酸內(nèi)切酶。在細(xì)菌防衛(wèi)的第三階段，crRNA介導(dǎo)Cas核酶切割靶DNA，靶DNA必須包含一個(gè)物種特異性的PAM（protospacer adjacent motif ）序列。不同的Cas蛋白識(shí)別不同的PAM序列，最常見的 S. pyogenes Cas9 (SpCas9) 識(shí)別的PAM序列是5’ NGG 3’，雖然NGG在人類基因組中平均每8個(gè)堿基出現(xiàn)一次，但還是有其限制性，由此衍生了很多SpCas9變種酶或者SpCa9直系同源酶如SaCas9。 Cpf1與Cas9除了識(shí)別的PAM位點(diǎn)不同外，其CRISPR系統(tǒng)也有幾點(diǎn)不同。1) CRISPR-Cas9系統(tǒng)中成熟的crRNA會(huì)與tracrRNA部分堿基互補(bǔ)配對（crRNA和tracrRNA稱為gRNA，有時(shí)會(huì)將其融合在一起稱為sgRNA，single guide RNA）形成一個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)招募Cas9蛋白，而CRISPR-Cpf1系統(tǒng)crRNA獨(dú)自形成一個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)招募Cpf1蛋白；2) Cas9-crRNA復(fù)合物切割靶DNA形成一個(gè)平末端的雙鏈斷裂缺口，而Cpf1-crRNA切割靶DNA形成一個(gè)黏性末端。這就提出問題，與Cas9系統(tǒng)相比，Cpf1系統(tǒng)不需要tracrRNA，而且黏性末端可能更有助于發(fā)生同源重組修復(fù)，是否Cpf1酶更好呢？ 關(guān)于CRISPR技術(shù)應(yīng)用，有兩個(gè)關(guān)鍵的影響因素，在靶率（on-target efficiency）和脫靶率（off-target efficiency）。在靶率可以理解為crRNA識(shí)別靶DNA并對其成功切割的效率。脫靶率是crRNA不單識(shí)別靶DNA，其他個(gè)別堿基不同的DNA也可識(shí)別并切割，這就產(chǎn)生錯(cuò)配容忍率，應(yīng)用在基因組中，本來只需要切割A(yù)基因，結(jié)果正常的B基因也被切斷了，會(huì)造成生物安全性問題。好比灰姑娘的水晶鞋，只能灰姑娘穿的下，若是換其他種類水晶鞋，腳大一碼小一碼均可穿下，王子怕是難找到灰姑娘了。 Kleinstiver等對Cpf1和Cas9做了比較，兩種Cpf1核酶AsCpf1和LbCpf1在靶率低于SpCas9，但是其特異性強(qiáng)于SpCas9，AsCpf1和LbCpf1對錯(cuò)配堿基的容忍度是1-2個(gè)，而SpCas9可以容忍3-4個(gè)。 總之，兩者均有不足。CRISPR技術(shù)日新月異，對于Cas9，集中在提高其特異性上，主要改造針對Cas9自身，諸如改變Cas9蛋白的結(jié)構(gòu)，給其融合一個(gè)DNA結(jié)合域或者FokI核酶，2018年報(bào)道的利用化學(xué)修飾法將部分crRNA的RNA序列變?yōu)镈NA也可提高其特異性等。相比Cas9，Cpf1有很多超過Cas9的優(yōu)點(diǎn)，如Cpf1比Cas9序列短，可以用于包裝腺病毒，但其研究相對較少，Su Bin Moon等于2018年9月提出crRNA識(shí)別20個(gè)靶DNA且3’端加幾個(gè)U可以提高Cpf1系統(tǒng)的在靶率，這為Cpf1的應(yīng)用提供了前景。 大家如果想做CRISPR，不妨找找最新的質(zhì)粒，效果沒準(zhǔn)會(huì)更好。值得一提的是，Addgene https://www./，一個(gè)神奇的網(wǎng)站，點(diǎn)擊搜索框，搜索CRISPR，然后你會(huì)看到很多CRISPR相關(guān)的理論及應(yīng)用，感興趣的小伙伴可以自行查找。
參考文獻(xiàn)： ? Barrangou R. CRISPR-Cas systems and RNA-guided interference. Wiley Interdiscip Rev RNA. 2013 May-Jun;4(3):267-78. ? Makarova KS, Koonin EV,et al.An updated evolutionary classification of CRISPR-Cas systems. Nat Rev Microbiol. 2015 Nov;13(11):722-36. ? Cong L, Ran FA, Cox D, Lin S, Barretto R, Habib N, Hsu PD, Wu X, Jiang W,Marraffini LA, Zhang F. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.Science. 2013 Feb 15;339(6121):819-23. ? Zetsche B, Zhang F,et al. Multiplex gene editing by CRISPR-Cpf1 using a single crRNA array. Nat Biotechnol. 2017 Jan;35(1):31-34. ? Kleinstiver BP, Tsai SQ, Prew MS, Nguyen NT, Welch MM, Lopez JM, McCaw ZR,Aryee MJ, Joung JK. Genome-wide specificities of CRISPR-Cas Cpf1 nucleases in human cells. Nat Biotechnol. 2016 Aug;34(8):869-74. ? Yin H, Song CQ, Suresh S, Kwan SY, Wu Q, Walsh S, Ding J, Bogorad RL, Zhu LJ, Wolfe SA, Koteliansky V, Xue W, Langer R, Anderson DG. Partial DNA-guided Cas9 enables genome editing with reduced off-target activity. Nat Chem Biol. 2018 Mar;14(3):311-316. ? Bin Moon S, Lee JM, Kang JG, Lee NE, Ha DI, Kim DY, Kim SH, Yoo K, Kim D, Ko JH, Kim YS. Highly efficient genome editing by CRISPR-Cpf1 using CRISPR RNA with a uridinylate-rich 3'-overhang. Nat Commun. 2018 Sep 7;9(1):3651. 基金、課題設(shè)計(jì)、科研輔導(dǎo)群 備注：入群學(xué)習(xí) 從以下20個(gè)熱點(diǎn)入手，每天給大家分享干貨：
而這些研究方向參與疾病發(fā)生發(fā)展過程的分子機(jī)制，可以歸納總結(jié)為一下幾類研究： ①分子（DNA、RNA、蛋白質(zhì)、小分子）的表觀遺傳修飾； ②分子拷貝數(shù)的表達(dá)變化差異； ③RNA分子的剪接加工、出核、細(xì)胞組織水平的時(shí)空變化研究； ④特殊的一群細(xì)胞類型研究、細(xì)胞通訊微環(huán)境研究； ⑤具有臨床應(yīng)用潛力的新技術(shù)（CRIPSR）或者載體（膜結(jié)構(gòu)、細(xì)胞等）； ⑥關(guān)注細(xì)胞生理學(xué)現(xiàn)象：自噬、凋亡、線粒體失功等； |
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