摘要：

16SrRNA基因是微生物生態(tài)學中應用最廣泛的標記基因，通常根據(jù)16S測序結果來估計微生物群落中細菌和古菌的比例。然而由于不同生物體含有不同的16S基因拷貝數(shù)（gene copy numbers, GCNs），更大GCNs的分支往往會在測序中得到更多的序列，從而使得結果的相對豐度高于實際值。近來，一些基于測序基因組來預測GCNs的方法陸續(xù)被開發(fā)出來，這些方法使用了系統(tǒng)發(fā)育的方法以糾正前述偏差，但其預測的準確性還沒有經(jīng)過評估。本文作者基于6800個公共測序基因組并運用多種系統(tǒng)發(fā)育方法，對16S GCNs在細菌和古菌分支上的可預測性進行了系統(tǒng)評估，并在更廣泛的類群和來自不同環(huán)境的635個微生物群落中，對PICRUSt、CopyRighter、PAPRICA等三個最近公布的方法的預測準確性進行了評估。

結果發(fā)現(xiàn)，無論哪種方法，16S GCNs只能準確預測一個有限的分類群（<15%>）。一致的是，這些工具在預測全基因組時表現(xiàn)出較低的準確度，在某些情況下，甚至只能解釋不到10%。幾個測試微生物群落之間的工具也存在很大的誤差。微生物群落的最相似序列分類指數(shù)（nearest sequencedtaxon index, NSTI），即測序基因組的平均距離，對于非動物相關樣本可以進行有力預測，但對于動物相關樣本結果稍遜。因此，一般情況下作者不建議在微生物研究中糾正16S GCNs。

1.從系統(tǒng)發(fā)育的角度16S GCNS的可預測性

16S GCNs的自相關函數(shù)，即在一定的系統(tǒng)發(fā)育距離上兩個隨機挑選的OTU的GCNs之間的相關性，隨著系統(tǒng)發(fā)育距離的增加而適度衰減（圖1A），在系統(tǒng)發(fā)育距離約15%的情況下下降到0.5以下，在系統(tǒng)發(fā)育進化距離約30%時降為0。因此，16S GCNs的預測對于具有大于約15%的NSTD的分支和接近NSTD大于約30%的分支是不準確的。為了明確測試這一結論，作者基于SIVLA衍生樹隨機16S GCNs進行預測，并比較了這些預測和從已知的完整測序基因組的GCNs。作者使用了以下常見的兩種重建算法預測GCNs：對于CopyRighter和PICRUSt使用PIC算法, 對于PAPRICA使用subtree averaging算法。結果發(fā)現(xiàn)所有的預測方法僅實現(xiàn)了NSTD低于15～30%的高精度（圖1C），符合原本基于自相關函數(shù)的期望。在SILVA衍生的樹中，大約49%的OTU具有大于15%的NSTD，并且大約30%的OTU具有大于30%的NSTD（圖1B）。由于Silva數(shù)據(jù)庫中自然界的環(huán)境微生物群落不是純隨機的取樣，因此這些生物一般預測NSTDs會較低。此外，很可能有大量的原核生物尚未被包括在SILVA，例如從最近發(fā)現(xiàn)的或尚未發(fā)現(xiàn)的一些門，NSTD可能大于30%。因此，基于測序基因組的16S GCNS的預測對于大多數(shù)現(xiàn)存的天然環(huán)境中的原核分支來說是不準確的，樹的拓撲和分支長度的誤差可能降低系統(tǒng)發(fā)育重建工具的預測精度（圖1C）。

圖一 16S基因拷貝數(shù)的系統(tǒng)發(fā)育信號

（SILVA衍生樹）

2.第三方預測工具的評估

前面的分析表明，基于可用測序基因組的16S GCNs的系統(tǒng)發(fā)育預測對于大量的原核分支來說是不準確的，特別是那些僅具有少數(shù)測序代表的物種。這一發(fā)現(xiàn)引發(fā)了對16S GCNs可以準確預測典型環(huán)境群落的質疑，16S GCN校正應該被系統(tǒng)地應用于每一個微生物群落研究。因此，作者測試了PICRUSt v1.1.1、CopyRighter v0.46和PAPRICA v0.4.0b最近出版的三種工具的預測精度。作者進行了兩種類型的測試：第一個測試將上述測序基因組的GCNS與基于基因組16S序列的每個工具預測的GCNs進行比較；第二個測試將每個工具的預測與其他兩種工具的預測進行比較，對于Greengene 16S rRNA數(shù)據(jù)庫中的所有OTU以及來自不同范圍環(huán)境中的635個微基因組中發(fā)現(xiàn)的原核OTU進行比較。結果發(fā)現(xiàn)，三種工具的預測準確度和以真GCNs的解釋方差的部分來測量的預測精度通常隨著基因組的NSTD而降低（圖2）。對于PICRUSt和PAPRICA，R²甚至對NSTD在30%以上都是負的。

圖二 GCN預測工具對

已知GCN基因組的評價

不同的工具之間在評估整個Greengene數(shù)據(jù)庫時，預測的GCNs與其他工具的預測中方差最多為25%（圖3）。CopyRighter和PICRUSt使用相同的輸入基因組和相似的參考樹集合，然而所得結果基本不同（圖3a）。當考慮依賴于OTU的NSTD工具之間的差異時，發(fā)現(xiàn)R²隨著NSTD的增加而迅速減小，并且在NSTD低于20%時變成負（圖3d-f）。

圖三 基于Greengenes各工

具之間16S GCN預測的比較

作者用635個樣本來比較這三種工具，發(fā)現(xiàn)對于任何兩種工具來說(CopyRighter vs. PICRUSt,PICRUSt vs. PAPRICA, CopyRighter vs. PAPRICA)，第一工具預測的方差由第二工具（R²）的預測解釋低于0.5的超過84%的樣本，低于0.1超過55%的樣本（圖4）。在許多情況下，工具之間的一致性甚至比工具之間不相關的預測更差。在PICRUSt和PAPRICA之間發(fā)現(xiàn)了最差的一致性，而CopyRighter和PICRUSt之間發(fā)現(xiàn)了最好的（但仍然是不好的）一致性。這進一步加強了文章的結論，現(xiàn)有的GCN預測工具對這些樣本中的許多樣本表現(xiàn)不佳，即使只考慮與動物相關的樣本（例如人類皮膚樣本）。動物樣本被認為是比其他環(huán)境更好的研究，并通常具有較低的NSTIs（加權平均NSTD的OTU），結果發(fā)現(xiàn)工具之間仍存在不一致性。一種解釋是，即使在人類相關的微體系中，許多具有高NSTD的OTU降低了總體預測精度。事實上結果發(fā)現(xiàn)，在大多數(shù)樣本之間的工具之間的不一致性不是單獨由一些特異OTU驅動，而是反映在每個樣本中大量OTU的中度到較差的一致性。而對于非動物樣本，則趨勢更為明顯。很可能是由于許多被忽略的分類，尤其是研究不夠深入的門類，甚至比一些特異的OTU具有更大的NSTD。

圖四 GCNs預測工具在

微生物群落中的一致性

以前的研究曾經(jīng)使用模擬群落來測試16S GCNs的可預測性，表明正確的校正GCNs可以提高微生物群落組成的估算準確性。因此，使用模擬群落而不是自然群落，可以使GCNs得到很好地預測，因為每一個單位的GCNs都是已知的。

結論：

作者評估了16S GCNs的系統(tǒng)發(fā)育保守性，并使用幾種常見的系統(tǒng)發(fā)育重建算法研究了GCNs的可預測性。其研究結果表明GCNS或許并不能預測大量現(xiàn)存的原核分支。此外，作者評估了三種可用的16S GCN預測工具在一組完全測序基因組上的準確性，以及在Greengene 16S數(shù)據(jù)庫和來自廣泛環(huán)境的微生物群落中的OTU的準確性。分析結果表明，現(xiàn)有的工具在大部分基因組與OTU測試中表現(xiàn)不佳；對于超過85%被檢查的微生物群落，GCN預測在幾種工具之間差異很大。因此，由于測序基因組覆蓋不足，16S GCN預測對于現(xiàn)存的原核多樣性的很大一部分是不精確的，這與通常的假設恰恰相反。因此作者建議，16S GCNs應僅在具有低NSTI（15%）的微生物群落的研究中被校正。

參考文獻：

Louca S, Doebeli M, Parfrey L W. Correcting for 16S rRNA gene copy numbers in microbiome surveys remains an unsolved problem[J]. Microbiome, 2018, 6(1): 41.