基本原理
許多蛋白質(zhì)分子在其表面含有較多的賴氨酸殘基。這些賴氨酸殘基的游離e-氨基可與FITC(其激發(fā)波長(zhǎng)為492nm,發(fā)射光波長(zhǎng)為525nm)共價(jià)結(jié)合。與FITC結(jié)合的抗體可用為特異性的探針,以測(cè)定細(xì)胞相應(yīng)抗原的存在。FITC具有很高的量子產(chǎn)量(發(fā)射光與吸收光的比值,0.85)形成的偶聯(lián)物的穩(wěn)定性很好。FITC是應(yīng)用最廣的熒光染料,流式細(xì)胞儀就按FITC的特性,設(shè)計(jì)了激光波長(zhǎng)為488nm,很接近于FITC的最大激發(fā)波長(zhǎng)492nm)
偶聯(lián)反應(yīng)是在pH9.8條件下,賴氨酸殘基的游離e-氨基與FITC發(fā)生的親核反應(yīng),由此形成硫脲連接。
試劑及儀器
待偶聯(lián)抗體
碳酸氫鈉緩沖液:25mmol/LNa2CO3/
Nahco3緩沖液pH9.8(新鮮配制,配法見附錄)
疊氮鈉(有毒試劑)
庵氰酸熒光素(I型異購(gòu)體,有商品供應(yīng))
電磁攪拌器
操作步驟
1.用碳酸氫鈉緩沖液pH9.8稀釋抗體為1-5mg/m1,或抗體對(duì)該緩沖液充分透析,以足以使賴氨酸不解離(去其正電荷),但注意保持大部分蛋白質(zhì)仍未變性
2.將透析袋放入100m1含0.1mg/ MI
fitc的pH9.8碳酸氫鈉緩沖液(新配制)的燒杯中,用鋁鉑包燒杯以避光,4℃攪拌過夜
3.上述抗體液對(duì)PBS在4℃透析以終止反應(yīng)。其間至少更換PBS液三次,直致480nm的吸收為零
4.加入0.5g/L的疊氮鈉。此后,結(jié)合物在4℃避光保存,或分裝后在-20℃凍存
熒光偶聯(lián)質(zhì)量的檢測(cè)
用標(biāo)準(zhǔn)免疫熒光染色試驗(yàn)以測(cè)定偶聯(lián)率
或用F/P值測(cè)定對(duì)其FITC標(biāo)記質(zhì)量進(jìn)行鑒定
取結(jié)合物液0.2ml,加PBS2.8ml(或兩者均改用半量),測(cè)定其A490/A280,查FITC標(biāo)志曲線得其濃度ug/ml值,按IgG的消光系數(shù)(mg/ml約A2801.2),可計(jì)算其F/P值,即每mg抗體所標(biāo)記的FITC的比值,可以此鑒定及比較各批標(biāo)記物的質(zhì)量
實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)及說明
1.偶聯(lián)反應(yīng)要求在盡可能接近pH9.8的溶液中進(jìn)行,而且注意在反應(yīng)過程中要保持此pH水平
2.要確定在偶聯(lián)反應(yīng)緩沖液中不含游離氨基(Tris,氨及疊氮鈉均可與FITC反應(yīng),因此會(huì)降低蛋白質(zhì)與FITC的偶聯(lián)率)
3.FITC與蛋白質(zhì)的比值(F/P),可通過測(cè)定495m與280nm吸光度來鑒定。此比值的范圍應(yīng)為0.3-1.0(方法見前)
4.FITC唯一的缺限是易被光淬滅,因此復(fù)合物必須始終避光保存
5.如果FITC一復(fù)合物對(duì)PBS透析不充分,可能造成高本底,對(duì)免疫熒光染色產(chǎn)生干擾
6.如果被標(biāo)記的蛋白質(zhì)是第二抗體或通用的第一抗體,則從商品購(gòu)置可能更方便可取
更多閱讀：抗體記法操作步驟及實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)說明
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