哺乳動物細(xì)胞具有和人類相似的復(fù)雜翻譯后修飾，常被用來表達(dá)具有活性的生物大分子蛋白。而這些生物大分子的功能發(fā)揮在一定程度上依賴于這些翻譯后修飾。3T3，BHK，293，CHO，NS0，Hela等細(xì)胞均被研究并用作生物大分子蛋白的表達(dá)，但是有近70%已經(jīng)上市的治療性蛋白是由CHO細(xì)胞表達(dá)生產(chǎn)的，CHO細(xì)胞已經(jīng)成為需要復(fù)雜翻譯后修飾的治療性蛋白生產(chǎn)的主要工具。這主要得益于CHO細(xì)胞的以下一些特點：1）具有和人類似的翻譯后修飾；2）清晰的歷史背景和監(jiān)管機(jī)構(gòu)的認(rèn)可；3）較少的分泌性內(nèi)源蛋白；4）在無血清及化學(xué)限定培養(yǎng)基中快速穩(wěn)健的懸浮生長；5）病毒安全性; 6) 四十多年來積累的知識和經(jīng)驗。隨著近些年在細(xì)胞工程及細(xì)胞培養(yǎng)基以及工藝開發(fā)方面的顯著進(jìn)展，CHO細(xì)胞的表達(dá)量獲得了非常顯著的提高，超過10g/L的流加培養(yǎng)工藝及25g/L的濃縮灌流培養(yǎng)工藝常見于學(xué)術(shù)期刊和會議報告。

CHO細(xì)胞最早由Puck實驗室在1957年分離，通過將0.1g中國倉鼠卵巢組織酶解消化獲得。酶解后大部分細(xì)胞屬于成纖維細(xì)胞，在進(jìn)行超過10個月的體外培養(yǎng)后，細(xì)胞并未表現(xiàn)出普通二倍體細(xì)胞的Hayflick界限，仍然可以繼續(xù)分裂生長，但是細(xì)胞形態(tài)從最初的成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變成近上皮細(xì)胞的形態(tài)。1958年P(guān)uke實驗室將此連續(xù)傳代細(xì)胞進(jìn)行重新克隆后，建立了我們現(xiàn)在所用的CHO細(xì)胞最原始細(xì)胞系。這個最原始的CHO細(xì)胞系是脯氨酸缺陷型的，必須在培養(yǎng)基中添加額外的脯氨酸以支持其生長，目前所有已知的CHO細(xì)胞系均保留了這個特性。這個最原始的CHO細(xì)胞系后來流轉(zhuǎn)到不同的實驗室和公司，經(jīng)過不同的培養(yǎng)、馴化、改造和重新克隆后形成了不同種類的CHO細(xì)胞系。這些細(xì)胞系雖然都是來源于最原始的CHO細(xì)胞系，但由于CHO細(xì)胞基因組內(nèi)在的不穩(wěn)定性及后續(xù)不同實驗室的篩選培養(yǎng)條件不同，不同CHO細(xì)胞系之間的形態(tài)、生長、表達(dá)、代謝、甚至基因組都有較大差異，下面就幾種常用的CHO細(xì)胞系進(jìn)行描述。 

• CHO-K1

CHO-K1是未經(jīng)改造的野生型CHO細(xì)胞。最初的CHO-K1是在1970年左右，由Puck和Kao的實驗室將原始CHO細(xì)胞系的一個亞克隆存放于ATCC（CCL-61），并命名。隨后源于ATCC CHO-K1的一個亞克隆在1985年被分離，并保存于ECACC（85051005），并被制藥公司和CMO公司用作重組蛋白的表達(dá)。最原始的CHO-K1細(xì)胞是貼壁培養(yǎng)，并需要添加血清，由于血清的批間穩(wěn)定性問題，及后來病毒安全性問題，無血清懸浮培養(yǎng)成為趨勢。其中Lonza公司從ECACC獲得CHO-K1馴化到懸浮無血清培養(yǎng)后，建立CHO K1 SV（Lonza，2002）細(xì)胞株，并廣泛應(yīng)用于其GS表達(dá)平臺。Merck（原SAFC）也是從ECACC獲得CHO-K1細(xì)胞株，并懸浮馴化至化學(xué)成分限定培養(yǎng)基中，形成了CHOZN^? CHO K1（Merck，2006）細(xì)胞株。

基于CHO-K1細(xì)胞的表達(dá)平臺多采用GS（谷氨酰胺合成酶）篩選系統(tǒng)和/或抗生素篩選系統(tǒng)。采用GS篩選系統(tǒng)的平臺可在轉(zhuǎn)入目的蛋白基因的同時轉(zhuǎn)入GS基因，在篩選階段采用不含谷氨酰胺的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。但由于CHO-K1細(xì)胞具有內(nèi)源的GS基因，因此在篩選時往往需要添加MSX甚至和一定量的抗生素同時篩選，以提高篩選效率。此外，由于內(nèi)源GS基因的存在，篩選出的高表達(dá)克隆往往穩(wěn)定性較差，需要進(jìn)行充分的穩(wěn)定性評估后，方可用于后期的工藝開發(fā)及規(guī)模化生產(chǎn)。而單獨采用抗生素進(jìn)行篩選的平臺，因篩選效率較低，多用于研究階段。目前多個已經(jīng)上市的治療性蛋白是基于CHO-K1細(xì)胞進(jìn)行開發(fā)生產(chǎn)的。

• CHO-S

基于原始的CHO細(xì)胞系，1973年Thompson實驗室分離了一株可用于懸浮培養(yǎng)的CHO細(xì)胞，并將此細(xì)胞命名為CHO-S。雖然都來源于最原始的CHO細(xì)胞系，但從細(xì)胞歷史分枝上看，CHO-S和CHO-K1分屬于不同的代系。此細(xì)胞系在1980年代后期提供給當(dāng)時的Gibco公司，后者將此細(xì)胞馴化至CD CHO培養(yǎng)基中，建庫并以CHO-S名稱進(jìn)行推廣。因其能在無血清培養(yǎng)基中懸浮生長，并支持高密度培養(yǎng)，在早期常被用作瞬時表達(dá)宿主細(xì)胞。此后，相應(yīng)的GMP細(xì)胞庫被建立，并支持商業(yè)化授權(quán)開發(fā)。

• CHO-DXB11

CHO-DXB11（又名DUK-XB11）是由哥倫比亞大學(xué)的Urlaub和Chasin在1970-80年代通過伽馬射線誘變的方法獲得。CHO-DXB11細(xì)胞的雙等位基因中，一個DHFR基因被敲除，另一個DHFR基因僅包含一個錯義突變（T137R），這使得此細(xì)胞不能有效還原葉酸而合成次黃嘌呤（H）和胸苷（T）。在表達(dá)外源重組蛋白時，將外源的DHFR基因和目標(biāo)蛋白基因同時轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并通過缺乏HT的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。由于DHFR基因可以通過重組重排進(jìn)行基因擴(kuò)增，在適當(dāng)?shù)腗TX壓力下，可以通過DHFR基因的擴(kuò)增同時獲得目標(biāo)蛋白基因的擴(kuò)增，從而獲得更高表達(dá)的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株。在早期CHO細(xì)胞培養(yǎng)時通常需要加入血清，因此在當(dāng)時的細(xì)胞篩選protocol里面經(jīng)常會看到用透析血清來避免引入HT或其它核酸代謝底物。此外需要指出的是，CHO細(xì)胞平臺上第一個被批準(zhǔn)上市的tPA就是采用DXB11做為宿主細(xì)胞，并且此宿主細(xì)胞被Genentech用于后續(xù)的多個商業(yè)化產(chǎn)品生產(chǎn)。

• CHO-DG44

由于DXB11細(xì)胞中僅有一個等位基因被敲除，在長期傳代過程中，會發(fā)生低幾率的突變使宿主細(xì)胞重新恢復(fù)DHFR基因活性，造成篩選壓力的下降甚至導(dǎo)致重組蛋白表達(dá)量的下降。因此，獲得一個雙等位DHFR基因完全敲除的宿主細(xì)胞成為一個需求。Chasin實驗室先后通過化學(xué)誘變和伽馬射線誘變，最終在1983年篩選出了雙等位DHFR基因敲除的CHO宿主細(xì)胞，并命名為CHO-DG44。雖然和DXB11都屬于DHFR基因缺陷型，但從譜系分枝來看，DG44和CHO-S更為接近。因為DG44細(xì)胞完全缺失了DHFR基因的活性，并且可以無血清懸浮培養(yǎng)，使得篩選和加壓過程變得更加有效。目前多家公司及CDMO企業(yè)采用此細(xì)胞做為平臺進(jìn)行治療性蛋白的開發(fā)，已經(jīng)有多個產(chǎn)品進(jìn)入臨床及上市階段。

• CHOK1SV GS-KO

Lonza在其CHOK1SV細(xì)胞的基礎(chǔ)上，與Cellectis 合作并利用后者的Meganucleases技術(shù)將CHOK1SV細(xì)胞中GS的雙等位基因完全敲除，于2012年推出了CHOK1SV GS-KO細(xì)胞株。由于內(nèi)源性的GS基因被完全敲除，大大提高了篩選效率，縮短了穩(wěn)定細(xì)胞株的開發(fā)周期（相比CHOK1SV系統(tǒng)縮短了6周），同時提升了最終克隆的穩(wěn)定性?；贕S-KO細(xì)胞的GS Xceed表達(dá)平臺除包括宿主細(xì)胞株外，還包括相應(yīng)的質(zhì)粒及V8培養(yǎng)基系統(tǒng)。GS Xceed已經(jīng)在全球用于多個產(chǎn)品的開發(fā)，并向全球授權(quán)（Lonza一代CHOK1SV不給中國授權(quán)）。但由于V8培養(yǎng)基系統(tǒng)相對復(fù)雜，多數(shù)CHOK1SV/GS-KO客戶并未采用其培養(yǎng)基系統(tǒng)。

• CHOZN GS

Merck（原SAFC）于2006年通過ECACC獲得CHO-K1細(xì)胞株，并將其馴化至化學(xué)成分限定培養(yǎng)基CD Fusion中，然后進(jìn)行亞克隆建立CHOZN CHO K1細(xì)胞系。在此細(xì)胞系基礎(chǔ)上，通過ZFN（鋅指核酸酶）技術(shù)敲除GS雙等位基因，獲得GS缺陷型細(xì)胞株CHOZN GS，并于2012年推向市場。整個平臺除細(xì)胞株外，還包括質(zhì)粒、克隆構(gòu)建階段用的培養(yǎng)基及流加工藝平臺培養(yǎng)基。通過平臺化的培養(yǎng)工藝進(jìn)行細(xì)胞篩選，可將穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建及上游工藝開發(fā)周期縮減到18個星期。目前以CHOZN GS做為宿主細(xì)胞的多個項目已經(jīng)在全球多個國家推進(jìn)到臨床實驗階段。

• Others

除了上述在工業(yè)界應(yīng)用較多的細(xì)胞系外 ，還有其他一些CHO細(xì)胞系也在應(yīng)用。

如在歐洲應(yīng)用比較多的Selexis公司SURE CHO-M細(xì)胞株，其源于ECACC CHO-K1細(xì)胞系，并經(jīng)馴化后獲得，Selexis表達(dá)平臺同時運用MARs元件來提升篩選效率和目標(biāo)蛋白表達(dá)量，運用CHO-M的多個項目已經(jīng)推進(jìn)到臨床實驗階段并有一個分子獲得批準(zhǔn)上市。

Horizon的HD-BIOP1（GS Null CHO-K1）也是源于ECACC CHO-K1細(xì)胞系，通過rAAV技術(shù)將雙等位GS基因敲除，獲得GS缺陷型細(xì)胞，但由于基因編輯實驗過程中部分實驗關(guān)鍵材料記錄不全而引起監(jiān)管機(jī)構(gòu)的擔(dān)心，Horizon試圖通過全基因組測序來消除監(jiān)管機(jī)構(gòu)的擔(dān)心，但由于基因組數(shù)據(jù)過于龐大以及現(xiàn)在對整個基因組數(shù)據(jù)的解讀尚需時日，目前為止尚未在歐美國家獲得臨床實驗批準(zhǔn)。

盡管可以通過不同途徑獲得CHO細(xì)胞用于研究，特別是在科研院所不同實驗室之間的交流時常發(fā)生，但最終如果想走向商業(yè)化應(yīng)用，就要求所采用的宿主細(xì)胞必須有清晰的歷史背景信息，并且盡可能的確保記錄所有傳代培養(yǎng)過程中采用的關(guān)鍵原材料信息，以確保細(xì)胞株的安全性。特別是當(dāng)前對生命科學(xué)的了解還相當(dāng)有限，即便是對于轉(zhuǎn)基因食品，包括專業(yè)人士在內(nèi)的不同群體之間尚且爭論不斷，因此背景清晰且有成功進(jìn)入臨床或上市產(chǎn)品作為參考的宿主細(xì)胞更容易獲得監(jiān)管機(jī)構(gòu)的認(rèn)可。

此外需要注意的是，盡管在研發(fā)階段很多細(xì)胞株可以免費（或極低費用）使用，但一旦需要進(jìn)入商業(yè)化（臨床實驗）階段，均需要支付商業(yè)化生產(chǎn)許可費用。下表列舉了部分細(xì)胞株的研發(fā)及商業(yè)化授權(quán)費用模式供參考。

雖然CHO細(xì)胞相對其他幾種哺乳動物細(xì)胞有諸多優(yōu)點，但工業(yè)界對CHO細(xì)胞更高性能的追求從未停止。目前常用的CHO細(xì)胞尚存在一些缺陷，比如：

· 較長的穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建周期(4+月)；

· 較低的產(chǎn)量(<10g>

· 較長的細(xì)胞倍增時間(20+小時)；

· 多種宿主蛋白對下游純化造成壓力；

· 遺傳學(xué)的不穩(wěn)定性，造成細(xì)胞表達(dá)量隨著培養(yǎng)時間的延長而降低；

· 克隆內(nèi)部的異質(zhì)性；

· 蛋白質(zhì)量(PQAs)的異質(zhì)性;

這些問題的解決大多需要細(xì)胞工程學(xué)研究來解決。如通過鑒定細(xì)胞基因組中的“熱點”區(qū)域，并通過定點整合技術(shù)將目標(biāo)基因定點整合到基因組中，進(jìn)一步縮短細(xì)胞株構(gòu)建周期；通過優(yōu)化細(xì)胞代謝通路，提升代謝效率，提升細(xì)胞倍增速率；產(chǎn)量的進(jìn)一步提升可以通過過表達(dá)一些蛋白折疊輔助蛋白等來實現(xiàn)；敲除對細(xì)胞生長和蛋白分泌不相關(guān)的一些蛋白基因，可降低宿主細(xì)胞壓力，同時減少宿主蛋白對下游純化的干擾；蛋白翻譯后修飾在大分子藥效藥代過程中扮演著重要的角色，通過基因工程可以修改這些修飾相關(guān)酶的表達(dá)量，來調(diào)控翻譯后修飾。

目前已經(jīng)研究的一些靶點如上圖所示，其中一些靶點已經(jīng)被應(yīng)用到工程CHO細(xì)胞的改造。但如果計劃將這些改造應(yīng)用于商業(yè)化目的，就需要了解這些改造所牽涉到的靶點，及改造過程中所應(yīng)用的技術(shù)背后的知識產(chǎn)權(quán)問題。

細(xì)胞株在整個生物制造工藝中有著至關(guān)重要的地位，一株高產(chǎn)、穩(wěn)定的細(xì)胞株不僅使得上游生產(chǎn)工藝變得簡單，同時還可能有利于降低下游生產(chǎn)工藝的復(fù)雜度及整個生產(chǎn)工藝的成本。因此各大制藥公司均對細(xì)胞株的選用及穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建非常重視，而最終獲得的高產(chǎn)穩(wěn)定細(xì)胞株又是每一個在研產(chǎn)品的核心資產(chǎn)。中國目前還處在生物制藥行業(yè)的快速起步時期，有大量的人力財力投入到這場轟轟烈烈的開發(fā)進(jìn)程中，但早期對宿主細(xì)胞株的選擇和來源并未受到應(yīng)有的重視，致使許多項目在開發(fā)的后期才發(fā)現(xiàn)宿主細(xì)胞的背景信息不全面而影響項目進(jìn)度，甚至不得不重新開發(fā)，即便有些公司采取了一定的彌補手段，使得項目得以繼續(xù)推進(jìn)，但同時也為整個項目埋下了很大的隱患。最近兩年，隨著行業(yè)的逐步成熟，大家開始普遍重視對宿主細(xì)胞的選擇，除了要求有清晰的歷史背景信息外，在選擇時還要考慮研發(fā)周期、成本以及后期整體的生產(chǎn)成本。

1. G. Urlaub, E. Kas, A.M. Carothers, L.A. Chasin (1983), “Deletion of the diploid dihydrofolate reductase locus from cultured mammalian cells”, Cell, 33, pp. 405-412

2. Hauser, H. and R. Wagner (2014). Animal Cell Biotechnology: In Biologics Production

3. Fischer, S., R. Handrick and K. Otte (2015). 'The art of CHO cell engineering: A comprehensive retrospect and future perspectives.' Biotechnol Adv 33(8): 1878-1896.