1、病毒學(xué)上如何分類？

偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)屬于皰疹病毒科甲型皰疹病毒亞科，豬皰疹病毒Ⅰ型。PRV又稱傳染性延髓麻痹病毒、奇癢癥病毒、奧葉茲基氏病病毒。是引起牛、羊、豬、犬和貓等多種家畜和野生動物發(fā)熱、奇癢（豬除外）及腦脊髓炎為主要癥狀的皰疹病毒。PRV具有皰疹病毒的典型結(jié)構(gòu)。

2、病毒電子顯微鏡下的外形特征是怎樣的？

PRV電子顯微鏡下非常漂亮，PRV的結(jié)構(gòu)與所有的皰疹病毒一樣，它是由一種含基因組的核蛋白核心、二十面體核衣殼（其中包括162個殼粒）、蛋白殼皮和來源于含病毒編碼糖蛋白細(xì)胞膜的脂質(zhì)雙層膜組成。PRV呈球形或橢球形，成熟病毒粒子直徑介于150～180 nm之間、無包膜的病毒粒子直徑約110～150nm、核衣殼直徑為105nm～110nm。囊膜表面有長約8nm～10nm呈放射狀排列的纖突。

3、病毒基因組情況如何？

PRV基因組為高分子質(zhì)量的連環(huán)體線狀雙鏈DNA分子，二十面體立體對稱。分子量為87×106 (約150kb)，全長為143bp，G+C含量高達(dá)74%，約有70個ORF，可編碼70-100種蛋白，成熟的病毒粒子大約含有50種蛋白質(zhì)。在結(jié)構(gòu)上，PRV全基因組有長獨特區(qū)、短獨特區(qū)、末端反向重復(fù)序列和內(nèi)部重復(fù)序列四部分組成。目前PRV全基因組序列已測定，約有65種基因。這些基因主要編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、毒力蛋白、病毒復(fù)制相關(guān)的酶類及復(fù)制結(jié)合位點。到目前為止，已在皰疹病毒上驗證PRV有3個復(fù)制起始位點，其中兩個分別位于重復(fù)區(qū)(2x)和UL的中間部分，另一個具有獨特特征位于基因組左端。 毒力決定性蛋白可以分為病毒膜糖蛋白、病毒編碼酶和非必需衣殼蛋白。病毒編碼酶參與核酸代謝，是病毒毒力的主要決定因素，其活性減弱會導(dǎo)致病毒致弱。去除非必需衣殼蛋白gE也導(dǎo)致一些PRV毒株毒力的顯著下降。糖蛋白gE在PRV對神經(jīng)系統(tǒng)（包括三叉神經(jīng)和嗅覺通路）的侵入中起關(guān)鍵性作用。去除gE，則PRV不能入侵神經(jīng)系統(tǒng)。

對PRV基因組序列測定發(fā)現(xiàn)其由72個閱讀框組成，可編碼70種蛋白，目前已發(fā)現(xiàn)和命名的有gB、gC、gD、gE、gG、gH、gI、gK、gL、gM、gN11種糖蛋白。編碼gC、gE、gG、gI、gM和gN的基因為病毒復(fù)制非必需的，gB、gC、gD、gE和gI與病毒的毒力有關(guān)。此外，胸苷激酶、核苷酸還原酶、蛋白激酶等幾種酶也與病毒的毒力密切相關(guān)，其中胸苷激酶是PRV最主要的毒力基因。糖蛋白gB、gC、gD在免疫誘導(dǎo)方面最為重要。

PRV只有一個血清型，但毒株間存在差異。但將病毒的DNA用限制性內(nèi)切酶切斷時，可將日前已分離到的PRV毒株分為四個類型(I、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ)，美國、德國、荷蘭、日本和比利時分離株為 I、Ⅱ和其中間型，丹麥、瑞典等北歐國家的分離株為Ⅲ型，泰國為Ⅱ、Ⅳ型。歐美國家毒株主要為基因I型，亞洲國家毒株主要為基因II型，基因I型和基因II型核苷酸差異達(dá)2.93%，我國PRV毒株以基因II型為主，而Bartha疫苗為基因I型，這在一定程度上解釋了Bartha疫苗免疫豬場發(fā)病率相對較高的原因。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，我國早期毒株雙城株的基因組骨架為基因II型，其UL區(qū)的部分片段來自于基因I型。PRV的遺傳多樣性與基因組內(nèi)部的微衛(wèi)星序列緊密相關(guān)。PRV只有一個血清型，但在基因水平具有一定的遺傳多樣性。

4、PRV是怎樣復(fù)制的？

PRV的復(fù)制循環(huán)見圖。首先成熟的病毒粒子吸附到宿主細(xì)胞，接著病毒的囊膜和宿主細(xì)胞膜融合。在病毒粒子的黏附和融合過程中，病毒囊膜糖蛋白和作為其受體的細(xì)胞膜組分之間的相互作用起至關(guān)重要的作用。糖蛋白gC和細(xì)胞表面的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的相互作用是在PRV和靶細(xì)胞之間的最初聯(lián)系。另外，gD和2個細(xì)胞受體組（硫酸乙酰肝素蛋白聚糖和脊髓灰質(zhì)炎受體相關(guān)蛋白）也參與了PRV的對宿主細(xì)胞的黏附作用。侵入需要宿主細(xì)胞膜和病毒囊 膜的融合，融合過程至少需要4種關(guān)鍵性糖蛋白gB、gH、gL和gD。通過基因工程方式，突變?nèi)毕萜渲腥魏我环N蛋白，病毒的融合能力將下降。轉(zhuǎn)運核衣殼入細(xì)胞質(zhì)后，核衣殼沿微管系統(tǒng)靠近核膜并定位于核孔附近，這樣其一頂端并列于核孔。一般認(rèn)為 DNA通過此頂端離開病毒粒子進(jìn)入細(xì)胞核。隨后核內(nèi)發(fā)生的變化和病毒粒子的釋放見。

5、PRV實驗室培養(yǎng)難嗎？

很多細(xì)胞系和原代細(xì)胞都適合于PRV的培養(yǎng)，但是豬細(xì)胞系PK-15或SK-6一般應(yīng)用于PRV的培養(yǎng)。PRV誘導(dǎo)的細(xì)胞病變(CPE)一般出現(xiàn)在攻毒后24～72 h。但是，細(xì)胞可以培養(yǎng)至接種后5～6 d。單層細(xì)胞的折光性增強，隨之細(xì)胞從培養(yǎng)層脫離。也存在合胞體，其外觀是可變的。即便沒有明顯的CPE，建議也要盲傳兩代。

 6、環(huán)境中的抵抗力強嗎？　

PRV對外界環(huán)境的抵抗力較強，55℃50min、80℃3min或100℃瞬間才能將病毒殺滅。在低溫潮濕環(huán)境下，pH 6～8時病毒能穩(wěn)定存活；在干燥條件下，特別是在陽光直射下，病毒很快失活。

      在夏季PRV可以在干草上存活30 d，在冬季可以存活46 d。在pH 4～12的范圍內(nèi)，PRV比較穩(wěn)定。儲存在50%的甘油中，PRV可以在冷藏條件下存活154 d，且病毒的濃度幾乎不降。凍干的病毒可以持續(xù)存活2年。

      在4℃，豬肉熟化過程中，PRV是有活性的。尿中PRV，在冬季持續(xù)8～15周、在夏季持續(xù)3周仍具有感染力。泥漿中PRV，在冬季可存活2個月，在夏季可以存活1個月；在用生物熱處理的泥漿中，PRV在夏季5d失活，冬季12 d失活。在空氣流通的泥漿中（pH9.6，溫度高達(dá)44℃）病毒在50 h內(nèi)失活。在堆肥中， PRV在8～15 d后失活。在土壤中，在5～6周內(nèi)仍可分離到具有感染力的病毒。在麻袋或木頭上的PRV在冬季可以存活15 d，在夏季可以存活20d。在乳酸菌發(fā)酵的條件下，20～30℃之間可存活24 h，但在10℃可存活48 h，在5℃至少可以存活96 h。

      PRV對熱具有一定的抵抗力。在60℃條件下可存活30～60 min，在70℃條件下可存活10～15 min，在80℃條件下可存活3 min，在100℃條件下可存活1 min。PRV在常溫和低溫條件下很穩(wěn)定。在25℃條件下可存活約6周，在15℃條件下可存活9周，在4℃條件下可存活20周，在-40℃條件下可存活數(shù)年。然而， PRV在-18～-25℃條件下，12周即失活。 

     在pH 4.0～12條件下，PRV穩(wěn)定，甚至在 pH2.0和pH 13.5條件下，病毒尚需2～4h才能完全滅活。在高或低的pH值，同時伴有高溫環(huán)境下，病毒的存活時間明顯縮短。

7、對消毒劑的敏感性怎樣？

      對PRV有效的消毒劑包括石炭酸、5%苯酚、2%氫氧化鈉、碘化磷酸三鈉和氯苯雙胍己烷溶液。季銨鹽復(fù)合物、次氯酸鹽及其他各種消毒劑在有機物質(zhì)存在的條件下效果明顯降低。當(dāng)進(jìn)行大規(guī)模消毒時，可以采用比較便宜的消毒劑，如氯化鈣乳液（即氯化鈣溶解于水）、粗的氯化銨、1%甲醛。對于泥土消毒，建議每立方米使用Ca(OH)₂ 20 kg。 

8、致病機理如何？

    通過口鼻感染后，最初PRV在上呼吸道的上皮細(xì)胞內(nèi)發(fā)生復(fù)制。接著，感染扁桃體和肺，造成病毒以自由擴(kuò)散或通過感染白細(xì)胞的途徑在體內(nèi)擴(kuò)散，但在血液中呈間歇性出現(xiàn)，滴度低，難以檢測出。另外，病毒也進(jìn)入三叉神經(jīng)和嗅神經(jīng)末梢，侵人中樞神經(jīng)系統(tǒng)。PRV在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的復(fù)制以化膿性腦膜炎為特征，最終導(dǎo)致嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)紊亂。

      感染毒株的毒力，至少部分地取決于PRV的糖蛋白。根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)中PRV的復(fù)制情況，將這些蛋白分為非必需蛋白(gC、gE、gG、gI、gN)和必需蛋白(gB、gD、gH、gK、gL)。調(diào)節(jié)PRV黏附于靶細(xì)胞的糖蛋白具有特殊的意義，因為它們直接決定PRV的趨向性。最初的黏附是由PRV非必需蛋白gC和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的結(jié)合介導(dǎo)的。但是，這一作用不足以啟動 PRV囊膜和細(xì)胞膜之間的融合。必需蛋白gD調(diào)節(jié)PRV和gD受體的后繼黏附。gD與gD受體間的互作啟動穿入的必需環(huán)節(jié)。另外，gD、gB和gH-gL復(fù)合體也是病毒粒子穿入靶細(xì)胞所需的。但是，相對于HSV-1和BHV-1而言， PRV-gD在體外細(xì)胞與細(xì)胞之間的傳播是非必需的。因而，gD表型缺陷者（PRV-gD）可以感染細(xì)胞，并直接或間接在細(xì)胞和細(xì)胞之間傳播開來。 

      近來，研究者對與PRV侵染神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的蛋白進(jìn)行了詳盡的研究，通過對小鼠、大鼠、豬的研究表明介導(dǎo)PRV侵入神經(jīng)系統(tǒng)的關(guān)鍵蛋白質(zhì)為糖蛋白E。去除糖蛋白E可嚴(yán)重致弱PRV，但缺乏gE并不影響PRV在鼻內(nèi)接種小鼠和豬的鼻上皮細(xì)胞的初始復(fù)制。但是，PRV跨突觸傳給第二神經(jīng)細(xì)胞受到嚴(yán)重抑制。糖蛋白E是抑制PRV感染神經(jīng)系統(tǒng)的最重要非必需糖蛋白，糖蛋白1次之。

 9、潛伏期多長？

    潛伏感染是皰疹科病毒的共同特點之一，是指潛伏感染期病毒后以非活化的狀態(tài)存在于機體的感染神經(jīng)節(jié)中，感染動物無任何癥狀且不產(chǎn)生具有感染性的病毒粒子。潛伏的細(xì)胞可能逃避了免疫系統(tǒng)的清除。偽狂犬病毒感染后是終身帶毒的，除非淘汰掉這頭豬，否則它是一直在豬場散毒的。因潛伏期PRV具有激活和排毒的潛能，因此是成功控制和根除PR的最大挑戰(zhàn)之一。大量的研究表明，絕大多數(shù)處于潛伏期的豬是潛在的傳染源。所以，任何曾感染任一PRV毒株的豬（特別是血清學(xué)檢測陽性者）都可被認(rèn)為是傳染源。在PRV，處于潛伏期的豬具有持久的危險性，因其體內(nèi)存在病毒激活、排泄并傳染易感動物的危險性。      

PRV潛伏的主要部位為三叉神經(jīng)節(jié)(TG)、嗅球和扁桃體。子代病毒未產(chǎn)生時，在這些組織可以檢測到PRV的存在?？梢酝ㄟ^高度靈敏的方法檢測到LAT轉(zhuǎn)錄，如RT-PCR。在體外最常用的檢測PRV的潛伏期的方法是用PCR方法檢測病毒的某段基因。唯一相對可靠的檢測潛伏期的方法是給予大量皮質(zhì)類固醇，誘導(dǎo)病毒激活與排毒。地塞米松是偽狂犬病毒一個很好的激活劑，建議大家不要使用地塞米松等藥物。

      一般認(rèn)為，口鼻感染后，PRV首先在上皮組織復(fù)制或者直接進(jìn)入鼻咽部感覺神經(jīng)元的神經(jīng)末梢。經(jīng)過第一輪復(fù)制后，子代病毒大量產(chǎn)生，導(dǎo)致大量初級神經(jīng)元被感染。PRV在三叉神經(jīng)的定殖與再感染之間有一定聯(lián)系，潛伏PRV的神經(jīng)元不可能接受PRV其他毒株的再感染。這一干涉是由病毒還是由細(xì)胞所決定還不清楚。這些結(jié)果表明，致弱的活疫苗可以建立潛伏期去抑制野毒株的感染。

10、目前已分離命名的PRV毒株有哪些？

A.      我國早期經(jīng)典毒株黑龍江雙城株（S株，偽狂犬疫苗攻毒保護(hù)校檢毒株）。

B.       HB98疫苗毒株系武漢科前生物股份有限公司的PRV商品疫苗。

C.       Bartha-K 61毒株系梅里亞動物保健有限公司的PRV商品疫苗。

D.      Burcrest毒株系美國輝瑞制藥有限公司的PRV商品疫苗。

E.       馬興杰等從吉林某豬場疑似豬偽狂犬病發(fā)病仔豬的腦組織病料中分離出1株病毒，感染豬以后病理變化明顯，經(jīng)幼倉鼠腎傳代細(xì)胞系（BHK-21）接種、毒價測定、病毒形態(tài)觀察、PCR擴(kuò)增及相關(guān)動物試驗證實為豬偽狂犬病病毒（PRV）野毒，并命名為PRV-JL。

F.       有學(xué)者從河南某豬場分離到1株PRV（命名為PRV-HeN1）

G.      河南禹州PRV-YZ株。

H.      PRV變異毒株ZJ01株由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)姜平教授團(tuán)隊于2011年分離鑒定。

I.         化學(xué)藥品重點實驗室潘文等人從河南省某規(guī)?；i場的死亡仔豬中分離到1株疑似豬偽狂犬病病毒,命名為ZY-2014株。

J.        龍巖學(xué)院動物醫(yī)學(xué)研究所范克偉分離了 1株PRV野毒株并命名為PRVJiangxi-FZ株。

K.      喬永峰等從安徽六安某爆發(fā)偽狂犬病豬場送檢的流產(chǎn)仔豬腦組織樣品中分離獲得1株病毒,經(jīng)鑒定為偽狂犬病毒(pseudorabies virus,PRV),命名為PRV AH02LA株。

L.       范偉興從山東疑似豬偽狂犬病發(fā)病豬場分離了一株病毒，將其命名為魯A株(PRV LA Strain)。

M.     BUK-Dl3是世界上第一個獲得批準(zhǔn)使用的基因工程缺失疫苗株。

N.      PRV- ZLT （2012年分離的流行強毒株）。

O.      NIA-3 經(jīng)典強毒株。

P.       偽狂犬病毒閩A株PRV FA株。

Q.      偽狂犬病毒鄂A株PRV EA株。

R.       偽狂犬病毒上海株PRV Sh株(EF552427)。

S.       經(jīng)典強毒株美國分離株Becker和德國分離株Kaplan。

T.       馬來西亞株（FJ176390）、愛爾蘭Nia-1株（FJ605136）、韓國YanShan株（AY249861）、國外Rice株。

U.      陳磊等從新疆某豬場病死仔豬的腦組織中分離到一株疑為豬偽狂犬病病毒(PRV)毒株，鑒定其為豬偽狂犬病病毒，并命名為XIN-W株。

V.      偽狂犬病病毒H株。

W.     2013年下半年福建某免疫接種過豬偽狂犬病疫苗（Ｂａｒｔｈａ）的規(guī)?；i場大批妊娠母豬發(fā)生流產(chǎn)、新生仔豬發(fā)生共濟(jì)失調(diào)的神經(jīng)癥狀，疑似為豬偽狂犬病病毒感染發(fā)病癥狀，為確定發(fā)病原因，從該豬場疑似偽狂犬病病毒感染的仔豬腦、肝臟和肺臟中分離到一株未知病毒，ＰＣＲ檢測及測序比對鑒定為豬偽狂犬病病毒，并將分離的病毒命名為ＮＰ株。

X.      高俊鋒等在流行病學(xué)調(diào)查中分離到的1株偽狂犬病毒,命名為豬偽狂犬病毒C株。

Y.      曾智勇等成功分離獲得了1株豬偽狂犬病病毒貴州株GZ-Z1株。

Z.       郝飛等采集疑似豬偽狂犬病流產(chǎn)胎兒病料,采用細(xì)胞接毒分離培養(yǎng)、病毒蝕斑純化、病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察、易感動物接種試驗和病毒核酸鑒定分離到1株偽狂犬病病毒(PRV),命名為PRV Guizhou-DY株(GenBank登錄號為JX417716)。

AA. 河南省動物性食品安全重點實驗室分離的豬偽狂犬病毒原陽株。

BB.  中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所2012年從江蘇省太倉市某發(fā)病豬場分離到1株變異的偽狂犬病毒，命名為JS-2012。

CC.  2012年，從天津某免疫過PR疫苗豬場的發(fā)病仔豬腦組織中分離到了一株PRV變異株(命名為PRV TJ株)。

DD. 2013年黑龍江省某豬場發(fā)生仔豬死亡并且伴有神經(jīng)癥狀,采集死亡豬腦組織,經(jīng)PCR檢測、病毒電鏡觀察,確診為偽狂犬病病毒(PRV)感染,遂將該毒株命名為狂犬病病毒HLJ8株。

EE.  四川野毒株SN株、SS株、SQ株、SL株和SCZ株。

FF.   從廣東四會某豬場分離到一株疑為豬偽狂犬病病毒（PRV）的病毒，命名為偽狂犬病病毒GDSH株(EF552427)。

GG. 從山東省濱州市某規(guī)?；i場分離到1株豬偽狂犬病毒命名為PRV BZ株

HH. 從河南省某規(guī)?；i場的死亡仔豬中分離到1株疑似豬偽狂犬病病毒,命名為ZY-2014株。

II.      2012年, 胡睿銘 等從河南省某規(guī)模化豬場的流產(chǎn)胎兒的腦組織中,用PCR技術(shù)檢測到偽狂犬野毒,并分離到一株偽狂犬病毒PRVSMX2012。

JJ.     范克偉等2014年從福建省龍巖市某規(guī)模化豬場疑似豬偽狂犬病發(fā)病仔豬的腦組織中分離到1株豬偽狂犬病毒變異株,命名為PRV Fujian-LY株。

KK. 孫佳楠等從遼寧省成功分離到1株豬偽狂犬病病毒野毒株，暫命名為PRV LN1301株。

LL.   郁宏偉等從河北省某豬場疑似偽狂犬病的豬體內(nèi)分離到的一株偽狂犬病毒(PRV)，鑒定結(jié)果表明從該豬場分離到的病毒是豬偽狂犬病病毒,并命名為冀A株。

MM.王仰杰等從廣西玉林博自某豬場采集的發(fā)病仔豬大腦和內(nèi)臟病料中分離到一株病毒，結(jié)果證實該分離毒株為偽狂犬病病毒，命名為GXBB株。

NN. 姜艷芬等對陜西省部分地區(qū)6個集約化豬場的187份豬血清進(jìn)行了偽狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）野毒感染檢測，并對疑似偽狂犬病發(fā)病仔豬的內(nèi)臟及腦組織進(jìn)行了病毒分離鑒定，鑒定結(jié)果表明從該豬場分離到的病毒是PRV,并命名為WG株。

OO. 沈強等在流行病學(xué)調(diào)查中分離到1株病毒，經(jīng)鑒定為偽狂犬病弱毒株，定名為F971株。

PP.   黃偉堅等 從南寧市郊某豬場采集的發(fā)病仔豬大腦和內(nèi)臟病料中分離到一株病毒。證實分離的病毒株為偽狂犬病病毒 ,并命名為偽狂犬病病毒桂W株。

QQ. 郭廣富等從泰州市姜堰區(qū)某豬場發(fā)生的疑似偽狂犬病病豬中采集病料,接種PK15細(xì)胞,收取細(xì)胞病毒液并提取DNA,經(jīng)PCR檢測及間接免疫熒光鑒定,結(jié)果表明該分離株為豬偽狂犬病毒,命名為TAIZ130417。

RR.  張超范等從臨床疑似豬偽狂犬病發(fā)病仔豬的腦組織病料中，經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）證實為豬偽狂犬病病毒（PRV）野毒感染，采用無PCV1污染的豬腎細(xì)胞系（PK-15）分離培養(yǎng)，經(jīng)蝕斑克隆純化，培育1株細(xì)胞培養(yǎng)適應(yīng)毒，命名為PRV-JF株。

SS.   楊濤濤等為了解湖南省近年來偽狂犬病病毒(PRV)的分子流行病學(xué)情況,更好地控制偽狂犬病,2012-2014年從湖南平江、汨羅、瀏陽、長沙4地的4個規(guī)?；i場送檢的病料(腦組織)中檢測到PRV野毒。將腦組織接種PK-15細(xì)胞,經(jīng)PCR和動物接種鑒定為PRV。4個毒株分別命名為PRV-XiangA、PRV-GA、PRV-YY和PRV-LY。