作者：Elisa Corsiero (e dot corsiero at qmul dot ac dot uk)

Queen Mary University of London, London, England

譯者：潘海建 上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院食品科學(xué)與工程系

當(dāng)官審女犯，這游戲不可描述

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簡介

抗體結(jié)構(gòu)

免疫球蛋白（Ig）或抗體是免疫系統(tǒng)的重要組成部分，根據(jù)結(jié)構(gòu)它們扮演了雙重角色。它們1）能夠通過抗原結(jié)合片段位點(diǎn)特異性結(jié)合抗原，2）通過Fc段激活免疫系統(tǒng)其他細(xì)胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)（圖一）。它們可分為多克隆抗體-多種抗體能識別抗原多個(gè)表位和單克隆抗體（mAbs）。后者是高度特異性的抗體，只能識別抗原的某一特定表位，它們在40年前被首次發(fā)現(xiàn)。在過去的這些年里，單抗已經(jīng)成為基礎(chǔ)研究的無價(jià)之寶，被廣泛應(yīng)用于免疫組化、流式細(xì)胞、免疫印跡及相關(guān)技術(shù)中 [1] 。 除此以外，在最近的20年里，單抗也成為癌癥治療的重要組成部分。它們的醫(yī)療應(yīng)用可以擴(kuò)展到慢性炎癥疾病、移植和感染中 （例如HIV單抗在治療人類HIV疾病中效果顯著）。到目前為止，已有約30中單抗被FDA授權(quán)用于以上疾病的治療 [2] 。因此，人們對這種類型抗體的興趣逐年增長，該領(lǐng)域的研究也日益增加。

圖 1. 免疫球蛋白IgG結(jié)構(gòu)。 IgG分子的簡化表示顯示了兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)（Fabs段）和功能域（Fc段）。

人類的抗體分子包含兩個(gè)相同的重鏈和兩個(gè)相同的輕鏈，通過二硫鍵共價(jià)連接。每條鏈包含一個(gè)可變區(qū)（VH和VL）用于抗原識別，和一個(gè)恒定區(qū)發(fā)揮效應(yīng)功能（CH1-3和CL）（圖一）. 重鏈也包含一個(gè)鉸鏈區(qū)?；贔c部分，抗體可被劃分為五種：IgG， IgM， IgD， IgA，和IgE。重鏈和輕鏈都在氨基端有一個(gè)由110個(gè)氨基酸組成的可變區(qū)，它包含三個(gè)被稱為互補(bǔ)決定域（CDR1, CDR2和CDR3）的高變區(qū)，它們植入于四個(gè)保守的骨架區(qū)（FRs）。CDR3通常是最多變的區(qū)域，作為抗原結(jié)合位點(diǎn)的中心。

制造人源單抗的步驟

人源單抗可通過雜交瘤細(xì)胞，展示技術(shù)如噬菌體展示，和單分揀的人B細(xì)胞。還有幾個(gè)更復(fù)雜的技術(shù)在本文中不展開論述，包括 [3] :

將小鼠雜交瘤細(xì)胞的CDR區(qū)移植到人源的輕鏈可變區(qū)和重鏈骨架區(qū)；

利用表達(dá)人源Ig基因的轉(zhuǎn)基因小鼠（基于傳統(tǒng)的雜交瘤方法）表達(dá)人源單抗。

雜交瘤技術(shù)

雜交瘤技術(shù)是一種古老的方法，常被用于制備單抗。目前許多實(shí)驗(yàn)室仍在用該方法。該方法將產(chǎn)生抗體的B細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞系融合（雜交），然后在選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)，只有生產(chǎn)特定單抗的融合細(xì)胞能夠在選擇培養(yǎng)基中存活。

它是如何工作的？

B細(xì)胞從被特定抗原免疫的小鼠脾臟中分離出來，B細(xì)胞能針對該抗原生成特定單抗，通過富集獲得抗原特異性的B細(xì)胞種群。將這些B細(xì)胞與篩選的骨髓瘤B細(xì)胞系融合（即通過化學(xué)物質(zhì)或者病毒介導(dǎo)進(jìn)行融合），該骨髓瘤細(xì)胞缺少編碼次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT）的基因，且自身不能產(chǎn)生抗體。這一選擇過程是重要的，這兩種類型的B細(xì)胞被接入含有次黃嘌呤-甲氨喋呤-胸腺嘧啶核苷的選擇培養(yǎng)基（HAT培養(yǎng)基）中培養(yǎng)，只有雜交瘤細(xì)胞能夠存活，因?yàn)楣撬枇黾?xì)胞在該培養(yǎng)基中無法分裂，而能產(chǎn)生特定抗體的B細(xì)胞在分裂幾代后就死亡率。因此只有雜交瘤細(xì)胞能夠分裂和復(fù)制。經(jīng)過篩選能夠產(chǎn)生目的單抗的雜交瘤克隆，這些單抗就能夠從培養(yǎng)上清中分離出來。盡管該方法仍然是單抗制備的“金標(biāo)準(zhǔn)”，它有一些缺陷，即無限增殖和融合的效率通過很低，或者B細(xì)胞的成熟狀態(tài)也很重要 [4] 。為了克服這一缺陷，在2003年Michel Nussenzweig實(shí)驗(yàn)室開發(fā)出來高效克隆和表達(dá)單抗的方法，從流式細(xì)胞分離單個(gè)B細(xì)胞開始（詳見下面的段落）。

單細(xì)胞篩選技術(shù)

制備人源單抗的有效方法是基于流式細(xì)胞儀的B細(xì)胞單細(xì)胞分揀，Ig基因（包含重鏈和輕鏈基因）的PCR擴(kuò)增，以及隨后的體外抗體表達(dá)載體克隆。

它如何工作?

生產(chǎn)人單抗的單個(gè)B細(xì)胞分揀的策略是基于從單個(gè)細(xì)胞cDNA進(jìn)行人IgH，Igκ和Igλ的PCR擴(kuò)增。用特定的正義鏈和反義鏈引物PCR分別擴(kuò)增得到重鏈和輕鏈（κ和λ）。擴(kuò)增后將PCR產(chǎn)物克隆到特定表達(dá)載體中表達(dá)重鏈和輕鏈。該載體隨后被轉(zhuǎn)染進(jìn)人的細(xì)胞系中來表達(dá)人源單抗，通過培養(yǎng)基上清分離得到抗體。詳細(xì)步驟可參考這篇文章 [4] 。

噬菌體展示文庫

噬菌體展示于30年前出現(xiàn)，它最早是由MRC分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的Greg Winter等人和Scripps研究機(jī)構(gòu)的Richard Lerner, Carlos Barbas等人分別開發(fā)出來的。噬菌體展示文庫制備的單抗可以是Fabs、scFvs （單鏈可變片段）或sdAbs （單域抗體） （圖1和2a）。 抗體序列通常與基因III衣殼蛋白融合 [5-7] 。

圖 2. （a） scFv 結(jié)構(gòu)（左） 包含兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，一個(gè)重鏈可變區(qū)（VH）和一個(gè)輕鏈可變區(qū)（VL）通過一個(gè)柔性接頭連接； sdAb （右）結(jié)構(gòu)包含一個(gè)單一結(jié)構(gòu)域，通常是重鏈可變區(qū)。 （b） 噬菌體展示的一般步驟。

它如何工作?

所有抗體噬菌體展示文庫的原則都是基于將抗體的特異性和親和性（表型）與噬菌體顆粒序列（基因型）進(jìn)行的物理連接。隨后是快速抗原特異性抗體的體外篩選。如圖2b總結(jié)，將表面的多克隆噬菌體表達(dá)重組抗體與固定在磁珠、聚苯乙烯表面，或細(xì)胞表面的靶抗原進(jìn)行結(jié)合。經(jīng)過幾輪對非結(jié)合的噬菌體嚴(yán)格洗脫后，抗原結(jié)合的噬菌體通過pH值改變或蛋白酶消化被洗脫下來。篩選出來的噬菌體被用于感染大腸桿菌，來制備新的文庫用于下一輪的篩選。不斷重復(fù)這一“全循環(huán)”直到富集得到單克隆的噬菌體。抗體序列被復(fù)原，被用于表達(dá)重組抗體 [6] 。

日常使用的抗體序列和結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)資源

抗體序列的主要資源是The ImmunoGenetics Database （IMGT） （http://www./）。 IMGT是免疫球蛋白的全球資源，它被定期更新，包含抗體的所有種系基因序列。第二大有用的抗體序列網(wǎng)站是IgBLAST （http://www.ncbi.nlm./igblast/），它由NCBI開發(fā)特異性的包含免疫球蛋白的可變區(qū)序列。對于抗體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫，有一些好用的資源：Protein Data Bank （PDB） （http://www./pdb/home/home.do）， CATH數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站（http://www.）， 抗體晶體結(jié)構(gòu)（SACS）， IMGT-3D結(jié)構(gòu)-DB。有幾個(gè)好用的工具可用于抗體序列研究。它們中，抗體模型構(gòu)建Rosetta Online Server （http://rosie.）是3D結(jié)構(gòu)預(yù)測的開放網(wǎng)站。糖基化預(yù)測，NetNGlyc1.0 Server （http://www.cbs./services/NetNGlyc）被用于預(yù)測人源抗體N-糖基化位點(diǎn)的存在；NetOGlyc4.0 （http://www.cbs./services/NetOGlyc） 可用于O-glycosylation糖基化位點(diǎn)的預(yù)測。

單抗的體外表達(dá)

HEK293或CHO細(xì)胞系

抗體生產(chǎn)的最后步驟是它們在宿主系統(tǒng)中的表達(dá)。選擇哪種細(xì)胞系進(jìn)行轉(zhuǎn)染是很關(guān)鍵的，在開始表達(dá)項(xiàng)目前需要評估一下。的確，后來改變表達(dá)系統(tǒng)能夠影響您要制備的抗體活性。選擇宿主系統(tǒng)的重要性主要取決于蛋白質(zhì)的翻譯后修飾。特別是，對于抗體來說糖基化是最常見的翻譯后修飾，能夠影響蛋白折疊、穩(wěn)定性、溶解度、蛋白活性和免疫原性等 [8] 。表達(dá)系統(tǒng)包含細(xì)菌、酵母、動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲、植物以及體外表達(dá)系統(tǒng)。通常，哺乳動(dòng)物細(xì)胞被用于單抗制備，因?yàn)樗鼈兡苷_組裝并引入翻譯后修飾（Handbook of Therapeutic Antibodies 2E （2014））。 有幾種哺乳動(dòng)物細(xì)胞可作為宿主系統(tǒng)，然而每種系統(tǒng)的糖基化類型有所不同。通常，在研究實(shí)驗(yàn)室中能成功用于表達(dá)抗體的為中國倉鼠卵巢細(xì)胞（CHO）或人胚胎腎細(xì)胞（HEK293）. 然而，CHO系統(tǒng)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染效率低，產(chǎn)生的蛋白產(chǎn)量也不高。因此HEK293作為瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的主要細(xì)胞系。除了您該選擇哪種細(xì)胞系以為，還需要時(shí)刻記住制備抗體的糖基化類型與體內(nèi)真正循環(huán)的有所不同。下表總結(jié)了可用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的HEK細(xì)胞系類型:

表一： 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的HEK細(xì)胞系。

轉(zhuǎn)染試劑

商品化的轉(zhuǎn)染試劑試劑盒很多。因此根據(jù)您的實(shí)驗(yàn)挑選最好的是很重要的。要問的第一個(gè)問題是你希望獲得的蛋白產(chǎn)量，這取決于你用該抗體進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)的類型和次數(shù)。最常用最便宜的是聚乙烯亞胺（PEI）。PEI是一種陽離子聚合物，能夠?qū)NA聚合成陽離子顆粒通過內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞。一旦進(jìn)入細(xì)胞，囊泡能夠?qū)NA聚合物釋放到細(xì)胞質(zhì)中。復(fù)合物解體后DNA就能夠擴(kuò)散到細(xì)胞核中。PEI介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染主要局限在于能夠獲得的蛋白產(chǎn)量太低，通常在微克級別。不過對于初次篩選抗體庫已經(jīng)足夠了。如今市場上出現(xiàn)了幾種能提高蛋白產(chǎn)量的轉(zhuǎn)染試劑。雖然價(jià)錢更貴但它們的效率更高，這可以讓您免于多次制備同一種抗體，每次都能省掉一些其他步驟（即純化、質(zhì)量控制等）。Thermo Fischer Scientific網(wǎng)站上列出了主要的轉(zhuǎn)染試劑（http://www.）。總結(jié)如下表：

表二：抗體制備的常用轉(zhuǎn)染試劑。

表達(dá)質(zhì)粒

表達(dá)質(zhì)粒也是表達(dá)系統(tǒng)的重要組成部分，如今也完善起來。表達(dá)質(zhì)粒的優(yōu)化在于強(qiáng)啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的鑒定和優(yōu)化，來獲得更高的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平。確切來說，需要用到一些特定的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子，如巨細(xì)胞病毒（CMV），SV40， 延長因子啟動(dòng)子， 多瘤病毒增強(qiáng)子， 雞beta-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子。對于抗體制備來說，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染通常用到兩套載體，一套用來編碼重鏈一套編碼輕鏈。然而，共轉(zhuǎn)染有一些缺陷，例如需要大量的載體，這會增加成本，也費(fèi)時(shí)費(fèi)力。有一些研究通過利用同時(shí)表達(dá)重鏈和輕鏈的載體（一步法組裝）來解決這一問題 [9] 。

新形態(tài)抗體:非常規(guī)抗體

大多數(shù)用于治療的抗體為人源化抗體或嵌合單抗。這些單抗已經(jīng)被驗(yàn)證非常成功，但如今出現(xiàn)了一些非常規(guī)抗體，來提高組織滲透藥物代謝和藥理功效。 新形態(tài)的抗體包含F(xiàn)ab片段（輕鏈和重鏈的CH1區(qū)通過二硫鍵鏈接）， FV片段（V區(qū)），單鏈抗體-scFvs （用柔性肽段連接V區(qū)）。還有一些其他形態(tài)的抗體片段。如兩種不同特異性的抗體片段可連接起來形成雙特異性抗體或雙抗體。對非常規(guī)抗體的新形態(tài)的深入描述和它們應(yīng)用介紹的文章可在這里查看 http://dx./10.13070/mm.en.3.160 。

實(shí)驗(yàn)室水平上通過親和層析進(jìn)行抗體純化的方法

通常制備的抗體為IgG亞型的。因此對它們的純化方法是基于蛋白A或G的親和層析方法。人源抗體總結(jié)表格如下:

表三： 抗體亞類及相應(yīng)蛋白A/G結(jié)合水平。修改自Affinity Chromatography Handbook （GE Healthcare網(wǎng)站）

通過親和層析純化抗體是基于抗體的Fc段與固定在層析介質(zhì)上的特定配體（即蛋白A/G）的可逆反應(yīng)實(shí)現(xiàn)的。蛋白A和G均來自于細(xì)菌，分別來自金黃色葡萄球菌和鏈球菌。在于配體結(jié)合后（結(jié)合階段），可通過改變洗脫階段的pH值逆轉(zhuǎn)反應(yīng)。親和層析技術(shù)是一種能從大規(guī)模培養(yǎng)物（如培養(yǎng)上清）中一步法高效回收抗體的方法。GE Healthcare網(wǎng)站的抗體回收說明書很有用，它包含了樣品準(zhǔn)備和抗體純化的最常用步驟，可以作為您準(zhǔn)備進(jìn)行抗體純化的參考書（www.gelifesciences.com/Handbooks/Antibody_purification_handbook）。

小規(guī)模純化

抗體小規(guī)模純化在抗體篩選中很有用。它可通過以下步驟實(shí)現(xiàn)： i） 用能夠用蛋白A或G包被的層析柱或預(yù)包被的層析柱 （即一次性聚丙烯柱）； ii） 蛋白A或G包被的96孔板用于高通量篩選。在第二套系統(tǒng)中，抗體可上樣到孔中，沖洗和洗脫可通過離心或利用真空系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)。

大規(guī)模純化–?KTA系統(tǒng)

通常在實(shí)驗(yàn)室水平而非用于工業(yè)用途也需要制備不同量的抗體，從微克級別到克級別都用。因此利用自動(dòng)純化系統(tǒng)來增加產(chǎn)量和純度就非常重要了。在市場上，有幾個(gè)自動(dòng)純化系統(tǒng)大多利用了GE Healthcare的?KTA層析機(jī)器。在手動(dòng)純化（如上小規(guī)模純化）變得費(fèi)時(shí)的時(shí)候使用這些系統(tǒng)通常能得到重復(fù)性更好的結(jié)果。手動(dòng)純化變得費(fèi)時(shí)的原因包括： i）需要獲得更多抗體， ii） 樣品的初始量太大， iii）需要純化許多樣品。自動(dòng)層析系統(tǒng)價(jià)錢偏貴，但投資這些系統(tǒng)會使有一些應(yīng)用變得省時(shí)省力，節(jié)省樣品，最重要的是能提高產(chǎn)量。GE Healthcare有幾種?KTA的機(jī)器。主要的如下列出:

?KTA start

?KTA prime plus

?KTA xpress

?KTA pure

?KTA avant

?KTA pilot

?KTA ready

?KTA process

從1到5的?KTA用于實(shí)驗(yàn)室級別。從6到8的用于工業(yè)生產(chǎn)級別。更多細(xì)節(jié)請查閱： www.gelifesciences.com/Handbooks/Antibody_purification_handbook。

表面等離子體共振：Biacore

Biacore系統(tǒng)（圖3a）利用表面等離子體共振（SPR）原理實(shí)時(shí)監(jiān)測分子間相互作用。該分析包含兩個(gè)相互作用的分子，一個(gè)結(jié)合在傳感器（配體），另一個(gè)在將通過配體的溶液（分析物）中。抗體可以是配體也可以是分析物。在配體與分析物結(jié)合后，傳感器表面可生成與結(jié)合量等比例的反應(yīng)，來確定兆摩爾或納摩爾級別的濃度。Biacore系統(tǒng)在研究抗體中非常有用，因?yàn)樗芊从?

抗體與抗原相互作用的特異性；

抗體與抗原相互作用的動(dòng)力學(xué)和親和力；

特定分子的濃度。

圖 3. （a）生物傳感器例子（b）感應(yīng)圖示意圖；RU = 共振單元

共振單元（RU）可反映共振信號的改變，通常與時(shí)間相對應(yīng)，以感應(yīng)圖的形式呈現(xiàn)（圖3b）。

總結(jié)： 制備工業(yè)水平的抗體

如今，單抗制備已經(jīng)不僅僅局限于實(shí)驗(yàn)室中，有一些醫(yī)用用途的抗體也被制備出來了。因此，應(yīng)用于標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)步驟主要用于抗體篩選而不是醫(yī)療用途。確實(shí)，大規(guī)模制備用于人的抗體需要更加精確的策略和控制步驟，這些都需要標(biāo)準(zhǔn)化以制定高滴度抗體生產(chǎn)的平臺。確切來說，它包含了i）構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染而不是瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，ii）用生物反應(yīng)器培養(yǎng)細(xì)胞，iii）從分泌產(chǎn)物中去除細(xì)胞，以及利用多種層析和過濾技術(shù)從細(xì)胞培養(yǎng)上清中純化抗體，iv）改變緩沖液，將抗體重懸于希望的配方以滿足臨床用途。所有這些步驟都余姚不斷的質(zhì)量控制測試來確保安全和生物活性。因此所有這些步驟都只能在工業(yè)水平而不是標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室水平實(shí)現(xiàn)。

參考文獻(xiàn)

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本文由單抗觀察整理于來邦網(wǎng)

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