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PCR技術(shù)自1983Mullis發(fā)明以來，給生命科學(xué)帶來了歷史性的變化，現(xiàn)已成為分子遺傳學(xué)、基因組測(cè)序和作圖、法醫(yī)學(xué)、系統(tǒng)動(dòng)物學(xué)等各領(lǐng)域內(nèi)不可缺少的工具。但是，普通的PCR最長(zhǎng)只能擴(kuò)展2-3kb左右的短片段基因，對(duì)于5kb以上的長(zhǎng)片段基因很難有效的擴(kuò)增，這使PCR受到了很大限制。故人們一直以來都在嘗試?yán)肞CR擴(kuò)展出更長(zhǎng)片段的PCR。 “LongPCR”這個(gè)名詞和技術(shù)最早由美國華盛頓大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Barnes WM提出。其設(shè)想來自于他1992年一次實(shí)驗(yàn)錯(cuò)誤。最初他想用常規(guī)PCR方法擴(kuò)增來自Bacillus thuringiensis(Bt，蘇云金桿菌)的一種2kb的蛋白質(zhì)基因。在實(shí)驗(yàn)過程中使用的引物末端出現(xiàn)了差錯(cuò),模板鏈上是A的位點(diǎn)，其對(duì)應(yīng)的引物位點(diǎn)也是A，這一位點(diǎn)不匹配導(dǎo)致了PCR擴(kuò)增反應(yīng)終止,未得到預(yù)期產(chǎn)物。Barnes用的聚合酶是Klentaq1，是TaqDNA聚合酶N端缺失突變體，無外切酶和內(nèi)切酶活性。為解決模板--引物不匹配問題,他試著用另一種聚合酶Pfu來代替Klentaq1，此酶具3→5外切酶功能，但結(jié)果還是沒有得到預(yù)期產(chǎn)物。Barnes設(shè)想Pfu可能過多地切掉了引物末端的核苷酸，就將Klentaq1和少量的Pfu結(jié)合使用,竟然成功了。Barnes解釋其原因是“Pfu需要切除不匹配的核苷酸，使Klentaq 1繼續(xù)擴(kuò)增”。Barnes進(jìn)一步設(shè)想，如果引物與模板不匹配能導(dǎo)致PCR終止，那么聚合酶延伸過程中產(chǎn)生的不匹配是否也會(huì)對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)生同樣的終止作用呢？如果是的話，那么這就是限制PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度的主要因素。正是基于這種思路，Barnes確立了用雙聚合酶系統(tǒng)來擴(kuò)增長(zhǎng)目標(biāo)序列,即無外切酶功能的DNA聚合酶(主導(dǎo)酶，majorpolymerase)和具3→5校對(duì)功能的DNA聚合酶(校對(duì)酶，minorpolymerase) 的組合，最后得到了長(zhǎng)達(dá)28kb的產(chǎn)物。由此人們開始打開長(zhǎng)片段PCR的大門，最終科學(xué)家發(fā)展出了一種新PCR技術(shù)———長(zhǎng)PCR(longPCR)，用于擴(kuò)增大于5kb的DNA的片段。至今為止，長(zhǎng)PCR技術(shù)已成功地用于擴(kuò)增人類β球蛋白基因簇22kb的DNA的片段、噬菌體基因組42kb的片段和人類線粒體基因組16.3kb的片段。 我是從13年開始嘗試擴(kuò)增長(zhǎng)片段的，在經(jīng)過一些摸索，并不斷的改變PCR條件，終于擴(kuò)增出8.5kb長(zhǎng)的人類基因組DNA。經(jīng)過這兩年的時(shí)間，我整理了一些限制長(zhǎng)片段PCR的因素及一些解決方法： 1. DNA模板的質(zhì)量問題 a. 模板提取不完整，其中不含你的目的基因，或目的基因含量太低。這個(gè)情況下應(yīng)該使用較為新鮮的樣本以及較為溫和的提取方法來降低DNA模板因在提取過程中損傷情況。 b. 模板里面殘留某種試劑成份，可能抑制Taq聚合酶的活性，如果是這種情況，可以用試劑盒把模板再純化一下，或?qū)⒛０遄鰝€(gè)梯度稀釋以確定最佳的模板量。 2. DNA聚合酶的影響 a. Taq酶具有較高的錯(cuò)誤率，導(dǎo)致產(chǎn)物3’端出現(xiàn)錯(cuò)配堿基，DNA合成提前結(jié)束。這時(shí)應(yīng)該使用一些錯(cuò)配率更低的耐熱聚合酶，如klentaq、pfu、rTth、Vent等。從不同文獻(xiàn)中可以得到使用雙酶系統(tǒng)更有利于長(zhǎng)片段DNA的合成。 b. Taq酶在PCR的過程中活力下降，會(huì)增加非特異擴(kuò)增以及二聚體的出現(xiàn)。這時(shí)應(yīng)該使用緩沖能力較強(qiáng)的緩沖液，使緩沖液的pH值不會(huì)降得過低而影響酶活性；也可在PCR體系中添加一些促進(jìn)劑，以降低退火溫度或/和提高聚合酶的穩(wěn)定性，從而促進(jìn)長(zhǎng)片段擴(kuò)增的進(jìn)行；也可稍微降低變性溫度，以保證聚合酶的活性。 3. 在PCR過程中損傷了DNA模板，使其斷裂或脫嘌呤，導(dǎo)致長(zhǎng)片段PCR無法進(jìn)行。這時(shí)我們可稍微降低變性溫度或/和在PCR體系中添加一些促進(jìn)劑，以降低退火溫度，從而減少DNA模板的損傷。 4. 引物問題 a. 樣品自身的基因型差異導(dǎo)致擴(kuò)增失敗。也就是說你的引物與某些基因型的樣品結(jié)合的好，而和另一些基因型結(jié)合不好?？梢栽O(shè)計(jì)一對(duì)更保守的引物試試。 b. 引物設(shè)計(jì)的不好，會(huì)導(dǎo)致二聚體出現(xiàn)、非特異性擴(kuò)增或無法擴(kuò)增。長(zhǎng)片段PCR的引物設(shè)計(jì)原則和普通PCR一樣，只是較長(zhǎng)一些（21-34個(gè)核苷酸），以便提高退火溫度，從而提高反應(yīng)的特異性。但也不要太長(zhǎng)，以免引物間互補(bǔ)形成二聚體。 5. 模板的結(jié)構(gòu)復(fù)雜度 對(duì)于模板結(jié)構(gòu)復(fù)雜，如GC含量高（>60%），有二級(jí)結(jié)構(gòu)等，普通的長(zhǎng)片段PCR可能難以延伸下去，加入DMSO等助熔劑可幫助擴(kuò)增順利進(jìn)行，但DMSO有毒，而且用量需要優(yōu)化。 6. 非特異性擴(kuò)增或擴(kuò)不出條帶，這時(shí)可以通過調(diào)整PCR體系或調(diào)整PCR程序來減少非特異性。 根據(jù)這些經(jīng)驗(yàn)和資料，我首先對(duì)雙酶系統(tǒng)進(jìn)行確定，我先后用過許多公司不同的酶組合，最后我選擇了北京佳蘭生物的klentaq酶和pfu酶進(jìn)行組合，klentaq與pfu酶的比例是20:1。 接著，我先挑出一個(gè)能擴(kuò)增3.6kb的10×buffer（參考分子克隆實(shí)驗(yàn)指南（第三版）中長(zhǎng)片段PCR，上冊(cè)668頁），然后再用這10×buffer來擴(kuò)增8.5kb。當(dāng)然，8.5kb不是那么好擴(kuò)的，一開始并未擴(kuò)出目的基因，在經(jīng)過調(diào)整一些組分后，主要是增加了鎂離子和dNTPS的濃度，我將鎂離子濃度增加到4.5mM，dNTPS增加到750μM each。終于擴(kuò)出了8.5kb長(zhǎng)片段基因，雖然還有很多非特異性擴(kuò)增。下面來看看我的實(shí)驗(yàn)實(shí)例： 首先是模板，我要確保DNA模板的完整以及純度，我用的是全血DNA試劑盒（simgen）來提取人類基因組DNA，并將DNA測(cè)OD及跑電泳。其次是引物，我用的是資料中常用的Human β-globin gene 8.5kb引物，由英濰捷基合成。 引物：Forward TGATAGGCACTGACTCTCTGTCCCTTGGGCTGTTT Reverse ACATGATTAGCAAAAGGGCCTAGCTTGGACTCAGA 條件： 甜菜堿在此時(shí)對(duì)長(zhǎng)片段PCR反應(yīng)沒有促進(jìn)作用，反而有抑制作用，也許是甜菜堿將熔點(diǎn)降低以致退火溫度下降而阻礙了長(zhǎng)片段PCR反應(yīng)的進(jìn)行。 |
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