16S rRNA基因是原核生物所特有的基因，并且在原核生物中具有極高的拷貝數(shù)。全長(zhǎng)1 542 nt的DNA序列包含9個(gè)間隔的高變區(qū)，兼具特異性和保守性的16S rRNA基因序列作為微生物標(biāo)記被廣泛應(yīng)用于研究中。相比DNA探針、變性梯度凝膠電泳和Sanger測(cè)序等方法，高通量測(cè)序技術(shù)在16S rRNA基因序列研究中體現(xiàn)出極大的優(yōu)勢(shì)。以Roche，Illumina等為代表的第二代測(cè)序技術(shù)將16S rRNA基因測(cè)序的通量大幅提高，為研究者提供對(duì)特定環(huán)境微生物進(jìn)行全面分析的可能。目前，第二代測(cè)序技術(shù)已經(jīng)成為環(huán)境微生物研究的主流手段。但是，第二代測(cè)序技術(shù)在16S rRNA基因測(cè)序中存在的缺陷也不可忽視——測(cè)序片段短。第二代測(cè)序平臺(tái)中，測(cè)序片段最長(zhǎng)的是Roche公司開(kāi)發(fā)的454 GS FLX+測(cè)序儀，其測(cè)序片段長(zhǎng)度僅為700 bp。過(guò)短的測(cè)序片段使得研究人員在微生物16S rRNA基因測(cè)序中，只能選擇部分高變區(qū)進(jìn)行研究，這對(duì)研究結(jié)果的準(zhǔn)確性有較大影響。 

目前PacBio 測(cè)序儀的測(cè)序長(zhǎng)度可達(dá)到20 000 bp，這為基于16S rRNA基因測(cè)序的微生物研究提供更好的選擇。本文將為大家總結(jié)PacBio的SMRT測(cè)序技術(shù)在全長(zhǎng)16S rRNA的成功應(yīng)用，最后提出目前存在的問(wèn)題和可能的解決方案，以期為研究人員采用SMRT測(cè)序技術(shù)研究微生物16S rRNA基因提供參考。

利用Pacbio全長(zhǎng)16S擴(kuò)增子測(cè)序評(píng)估嬰兒配方食品安全性

研究方法

對(duì)30個(gè)嬰兒奶粉樣品（12份國(guó)產(chǎn)，18份進(jìn)口）進(jìn)行PacBio全長(zhǎng)16S擴(kuò)增子測(cè)序，測(cè)序平臺(tái)：PacBio RS Ⅱ，試劑：P6C4。

結(jié)果分析

1，微生物多樣性及相對(duì)豐度分析

“種”水平的微生物多樣性分析及相對(duì)豐度（相對(duì)豐度>1%）

2，國(guó)產(chǎn)和進(jìn)口奶粉的優(yōu)勢(shì)菌株存在差異

國(guó)產(chǎn)配方奶粉以Lactococcuspiscium(27.78%)和Lactococcus lactis(17.16%)為主。

分析進(jìn)口嬰兒配方奶粉的優(yōu)勢(shì)菌株，

1群以Streptococcus thermophilus(65.55%)為主，

4群以Lactococcus piscium(27.04%)為主，

2群和3群以Streptococcus thermophilus、Lactococcus lactis 和 Lactococcus piscium為主。

3，預(yù)熱處理和桿菌相對(duì)含量之間的關(guān)系

        通過(guò)乳清蛋白氮指數(shù)（whey protein nitrogen index，WPNI)可檢測(cè)乳品中乳清蛋白的變性度，反應(yīng)乳品的熱處理程度。本研究將樣品微生物群落“屬”水平上的相對(duì)豐度結(jié)合WPNI進(jìn)行分析，結(jié)果表明，預(yù)熱處理的溫度與芽孢桿屬（Bacillus sp.）豐度負(fù)相關(guān)，與鏈球菌屬（Streptococcus sp.）和乳酸菌屬（Lactobacillus sp.）正相關(guān)。

利用Pacbio全長(zhǎng)16S擴(kuò)增子測(cè)序于健康奶牛與乳房炎奶牛腸道菌群定量與宏基因組研究

牛場(chǎng)管理、病原菌感染和奶牛體質(zhì)等因素都可能造成奶牛乳房炎（體溫升高，乳房紅腫痛，體細(xì)胞數(shù)（SCC）升高，牛乳呈棕黃色，膿漿），導(dǎo)致巨額經(jīng)濟(jì)損失、增加細(xì)菌耐藥性、抗性基因污染，最終威脅食品安全。因此對(duì)益生乳酸菌在奶牛養(yǎng)殖中應(yīng)用研究具有重要意義

研究方法

選取健康組(CH，20頭 ，SCC< 30萬(wàn)/ml)，乳房炎組(cm，20頭，="" scc="">100萬(wàn)/mL) ，采用二代、三代測(cè)序技術(shù)相結(jié)合的方法從宏基因組角度完成了40頭奶牛糞便中微生物多樣性和Metagenome分析，探究揭示乳腺炎與奶牛腸道微生物及功能基因的關(guān)系。

結(jié)果

基于三代測(cè)序技術(shù)完成健康組、乳房炎患病組共40頭奶牛腸道微生物組成分析，共識(shí)別出319個(gè)細(xì)菌種，平均相對(duì)含量在0.1%以上的菌種共有28個(gè)。其中蝙蝠弧菌屬Vampirovibrio在乳房炎組含量高，該菌可引起輕度腹瀉與紅細(xì)胞溶血。真桿菌屬Eubacterium，顫螺旋菌屬Oscillibacter等產(chǎn)酸菌在健康組含量較高。α多樣性分析結(jié)果與Mann-Whitney檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，健康組微生物物種豐度和多樣性顯著高于乳房炎組，乳房炎組奶牛腸道微生物結(jié)構(gòu)趨于簡(jiǎn)單化。

利用Pacbio全長(zhǎng)16S擴(kuò)增子測(cè)序以評(píng)估苜蓿青貯的質(zhì)量

苜蓿是畜牧業(yè)中重要的飼料作物，它包含很多牲畜生長(zhǎng)所需的物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、維生素和礦物質(zhì)等，目前保存的方法就是青貯法，在貯藏時(shí)一般會(huì)加入乳酸菌促進(jìn)發(fā)酵過(guò)程。隨著SMRT技術(shù)長(zhǎng)讀長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)顯現(xiàn)，研究者通過(guò)SMRT測(cè)序?qū)λ膫€(gè)樣本添加產(chǎn)乳酸菌發(fā)酵前后的微生物菌落進(jìn)行了研究。

實(shí)驗(yàn)方法

四種以乳酸菌為基礎(chǔ)的添加劑處理苜蓿青貯；發(fā)酵過(guò)程中，添加劑有利于降低pH值和霉菌毒素，而增加有機(jī)酸；SMRT分析8個(gè)發(fā)酵后樣本，細(xì)菌種類和豐度顯著上升；在原料中，巨大芽孢桿菌是起始優(yōu)勢(shì)物種，經(jīng)過(guò)發(fā)酵后，添加劑中存在的乳酸片球菌和植物乳桿菌成為優(yōu)勢(shì)物種。

研究結(jié)果

1，所有樣本中共鑒定到960種細(xì)菌，其中12種細(xì)菌含量均大于1%；

2，發(fā)酵前后物種數(shù)和相對(duì)豐度變化很大；

3，發(fā)酵后飼料中的微生物組成與所添加的菌群有很大關(guān)系，基于UniFrac的PCoA分析顯示發(fā)酵前和發(fā)酵后的樣本組成差異很大。

發(fā)酵前后的微生物菌落比較

以上各項(xiàng)成果均提及到一項(xiàng)技術(shù)服務(wù)-Pacbio測(cè)序應(yīng)用于微生物群落分析，那么，PacBio SMRT測(cè)序在微生物群落分析中的優(yōu)勢(shì)有哪些？

PacBio平臺(tái)測(cè)序產(chǎn)生PhyloTags的過(guò)程中不需要擴(kuò)增，相較于其他測(cè)序平臺(tái)降低了測(cè)序平臺(tái)的特異性偏差；

PacBio平臺(tái)測(cè)序產(chǎn)生的PhyloTags具有超高的一致準(zhǔn)確性，并且能夠真實(shí)反映微生物的高GC/低GC區(qū)，不會(huì)產(chǎn)生擴(kuò)增偏好性。

PacBio公司正在努力改進(jìn)提高測(cè)序正確率，目前的P6-C4試劑的平均正確率可達(dá)86%以上，讀長(zhǎng)可達(dá)12Kb。隨著時(shí)間的推移，使用PacBio測(cè)序的16s指標(biāo)將逐漸達(dá)到Sanger擴(kuò)增子的水平。

關(guān)于TBC  

天津生物芯片三代測(cè)序平臺(tái)自2013年運(yùn)行至今，作為國(guó)內(nèi)比較早一批提供三代測(cè)序服務(wù)的機(jī)構(gòu)，現(xiàn)已形成以PacBio單分子測(cè)序RSII和Sequel“雙核”平臺(tái)為中心，現(xiàn)已成功利用三代測(cè)序技術(shù)完成細(xì)菌、真菌、昆蟲(chóng)、動(dòng)植物、人類等數(shù)百個(gè)物種的基因組、全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及分析工作，并開(kāi)發(fā)建立了基于三代測(cè)序技術(shù)的靶向測(cè)序、宏基因組測(cè)序、表觀遺傳測(cè)序、以及單細(xì)胞測(cè)序系列方案。 2003年至今，累計(jì)為客戶在國(guó)際權(quán)威期刊發(fā)表SCI論文178篇，其中包括：Nature、Nature Communication、PNAS、FEMS Microbiol Rev PLoS Genetics。  

歡迎致電022-66229538 或發(fā)郵件tjbiochipmk@126.com進(jìn)行咨詢TBC 16S全長(zhǎng)測(cè)序服務(wù)！

參考文獻(xiàn) 

1. Y. Zheng, etal., Using PacBio Long-Read High-Throughput Microbial Gene Amplicon SequencingTo Evaluate Infant Formula Safety. J Agric Food Chem (2016)

2，Weichen , etal.,BaoAssessing quality of Medicago sativa silage by monitoring bacterial composition with single molecule, real-time sequencing technology and various physiological parameters. Scientific Report(2016)