前面兩篇已經(jīng)講了內(nèi)毒素的相關(guān)知識(shí)，也指出了生物制品中內(nèi)毒素的來(lái)（wen）源(ti),今天這篇小編就來(lái)講講通過(guò)哪些技術(shù)可以去除內(nèi)毒素。又有讀者反應(yīng)小編開(kāi)頭費(fèi)話太多，為了不給這們客官機(jī)會(huì)，小編本篇直入主題。

一、 活性炭

活性炭具有很大的比表面積，對(duì)氣體、溶液中的無(wú)機(jī)或有機(jī)物質(zhì)及膠體顆粒等都有良好的吸附能力，其主要通疏水作用吸附內(nèi)毒素，但其對(duì)物質(zhì)的吸附作用是非特異性的，在吸附內(nèi)毒素的同時(shí)也會(huì)吸附目標(biāo)蛋白，這在生物制品生產(chǎn)過(guò)程中主要是蛋白抗原等物質(zhì)，導(dǎo)致蛋白損失在10%～20%。

而對(duì)于生物制品如疫苗，其抗原蛋白含量是產(chǎn)品指標(biāo)的主要衡量標(biāo)準(zhǔn)，因此一般企業(yè)不會(huì)采用這樣方法進(jìn)行內(nèi)毒素的去除，如確需使用，一般應(yīng)該選用藥用級(jí)大孔隙的木質(zhì)活性炭，它們用于吸附較大的分子，清洗干凈后干烤備用?；钚蕴考恿坎怀^(guò)10%，放4℃搖動(dòng)作用不超過(guò)12小時(shí)。因?yàn)樘砑恿窟^(guò)大，或作用時(shí)間太久，會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)蛋白損失率更大，得不償失。

二、 超濾

超濾是一種加壓膜分離技術(shù)，即在一定的壓力下，使小分子溶質(zhì)和溶劑穿過(guò)一定孔徑的特制的薄膜，而使大分子溶質(zhì)不能透過(guò)，留在膜的一邊，從而使大分子物質(zhì)得到了部分的純化。

超濾原理也是一種膜分離過(guò)程原理，超濾利用一種壓力活性膜，在外界推動(dòng)力(壓力)作用下截留水中膠體、顆粒和分子量相對(duì)較高的物質(zhì)，而水和小的溶質(zhì)顆粒透過(guò)膜的分離過(guò)程。（下圖為以水過(guò)濾原理示意圖為例：分為內(nèi)壓膜及外壓膜）

基于以上原理，可使用這種方法來(lái)進(jìn)行過(guò)濾是需要前提條件的。如果原液及保護(hù)劑的分子量與內(nèi)毒素分子量差別較大，可通過(guò)超濾來(lái)去除內(nèi)毒素。由于超濾過(guò)程在常溫下進(jìn)行，條件溫和無(wú)破壞作用，特別適宜對(duì)熱敏感物質(zhì)（藥物、酶）的分離濃縮等。但是內(nèi)素素一般與蛋白結(jié)合或其本身容易聚合形成大分子，其分子量與目標(biāo)蛋白差別不大，因此，導(dǎo)致超濾的效果不好。

三、凝膠層析

又稱(chēng)分子篩過(guò)濾、排阻層析等，其原理是根據(jù)待分離樣品分子大小進(jìn)行分離的一種方法。

內(nèi)毒素分子量較大為幾十萬(wàn)至上百萬(wàn)道爾頓，且常為多聚體并易與蛋白樣品結(jié)合為一體，因此可利用分子篩層析去除內(nèi)毒素，它的突出優(yōu)點(diǎn)是層析所用的凝膠屬于惰性載體，不帶電荷，吸附力弱，操作條件比較溫和，可在相當(dāng)廣的溫度范圍下進(jìn)行，不需要有機(jī)溶劑，并且對(duì)分離成分理化性質(zhì)的保持有獨(dú)到之處。對(duì)于高分子物質(zhì)有很好的分離效果。但其最大缺點(diǎn)是處理量小，處理時(shí)間較長(zhǎng)。

另外凝膠層析根據(jù)過(guò)濾的物質(zhì)不同，需要選擇不同的材料，不同的溫度及PH等條件，對(duì)于生產(chǎn)過(guò)程中的應(yīng)用來(lái)說(shuō)，需要多次的實(shí)踐后對(duì)最佳條件的摸索及確定，才能保證后期的層析效果。

四、親合層析

親合層析技術(shù)是免疫吸附劑在生產(chǎn)中的運(yùn)用使用生物大分子的純化變得簡(jiǎn)單，比如HIS、GST標(biāo)簽蛋白的純化。免疫吸附的原理基于抗原、抗體的特異性作用，以目標(biāo)蛋白作為抗原、將通過(guò)雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)的單克隆抗體偶聯(lián)于介質(zhì)上，以此介質(zhì)來(lái)吸附目標(biāo)蛋白，最常用的就是免疫共沉淀試驗(yàn)（Co-Immunoprecipitation）。

由于相互作用的高度特異性，理論上僅有目標(biāo)蛋白吸附于介質(zhì)上，內(nèi)毒素全部穿透，洗脫后將得到純度很高的無(wú)熱原產(chǎn)品。但實(shí)際上，由于介質(zhì)本身存在非特異性吸附，仍有少量的雜蛋白及內(nèi)毒素同時(shí)被吸附，這也是為什么很多疫苗生產(chǎn)廠家只能夠?qū)?nèi)毒素控制在很低的標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)，確不能將其完全去除的原因。這就種方法是目前部分企業(yè)使用的去除雜蛋白與內(nèi)毒素的方法，區(qū)別主要在于設(shè)備是否進(jìn)口，填料是否足量，前期條件是否摸索成熟、操作人員是否嫻熟等方面。

在使用這個(gè)過(guò)程中，最需要關(guān)注的點(diǎn)就是：填料中不可以有氣泡或過(guò)多存在氣泡，否則在很大程度上會(huì)影響蛋白純化的效果，導(dǎo)致產(chǎn)品中內(nèi)毒素或是雜蛋白的超標(biāo)，進(jìn)而影響產(chǎn)品的質(zhì)量。

五、離子交換層析

離子交換層析（Ion Exchange Chromatography簡(jiǎn)稱(chēng)為IEC），通過(guò)帶電的溶質(zhì)分子與離子交換劑中可交換的離子進(jìn)行交換而達(dá)到分離純化的方法。

由于內(nèi)毒素本身帶有負(fù)電荷，可與陰離子交換介質(zhì)Q Sepharose Fast Flow 或 DEAE Sepharose Fast Flow結(jié)合。在實(shí)際生產(chǎn)使用過(guò)程中，表明Q Sepharose Fast Flow的效果要優(yōu)于DEAE Sepharose Fast Flow，前者可使內(nèi)毒素降到1EU/ml以下，其主要操作如下圖。

六、疏水層析

疏水層析（hydrophobic interaction chromatography，HIC）從分離純化生命物質(zhì)的機(jī)制來(lái)看，也屬于吸附層析一類(lèi)。利用固定相載體上偶聯(lián)的疏水性配基與流動(dòng)相中的一些疏水分子發(fā)生可逆性結(jié)合而進(jìn)行分離。

該方法基于的是蛋白質(zhì)的疏水差異，在高鹽溶液中，蛋白質(zhì)會(huì)與疏水配基相結(jié)合，而其他的雜蛋白則沒(méi)有此種性質(zhì)，利用此種性質(zhì)，可以將蛋白質(zhì)初步的分離，用于鹽析之后的蛋白質(zhì)進(jìn)一步提純。

綜上，6種方法都可以用來(lái)進(jìn)行內(nèi)毒素的去除，只是去除的條件要求不同、去除的程度不同。想要很好地去除內(nèi)毒素就要投入資金購(gòu)買(mǎi)較好的設(shè)備、填料，聘用高級(jí)的專(zhuān)業(yè)人才，嚴(yán)格按照規(guī)章制度進(jìn)行操作，這樣才會(huì)很好的降低或控制內(nèi)毒素在生物制品如疫苗中的含量。

最后，用一張圖來(lái)結(jié)束本篇文章。生物制品任何一個(gè)產(chǎn)品的出廠都需要這個(gè)系統(tǒng)資源的投入與正常運(yùn)轉(zhuǎn)，一旦任何一個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)生差錯(cuò)，就極有可能導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量的不穩(wěn)定或不達(dá)標(biāo)。