前言

近些年，CRISPR-Cas系統(tǒng)頻頻登上“CNS”，其強(qiáng)大的基因編輯能力迅速讓其從基礎(chǔ)研究轉(zhuǎn)化到臨床試驗(yàn)。隨著越來(lái)越多CRISPR-Cas家族成員的發(fā)現(xiàn)以及基礎(chǔ)研究的進(jìn)展，CRISPR的應(yīng)用范圍也越來(lái)越廣。今天，小編就詳細(xì)介紹下Class 2家族CRISPR的作用機(jī)制，以及它們?cè)诨蚓庉?，靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)，核酸   檢測(cè)等多方面的進(jìn)展。

CRISPR系統(tǒng)簡(jiǎn)介與分類(lèi)

為了應(yīng)對(duì)外來(lái)病毒和質(zhì)粒的入侵，細(xì)菌和古生菌進(jìn)化出了一套獲得性免疫系統(tǒng)CRISPR-Cas。CRISPR-Cas系統(tǒng)主要包括由Cas基因組成的操縱子和CRISPR陣列，其中CRISPR由外來(lái)基因組靶標(biāo)序列（spacers）和相同的重復(fù)序列（direct repeat）所構(gòu)成。CRISPR-Cas系統(tǒng)發(fā)揮作用主要包括Adaptation，crRNA maturation以及Interference三個(gè)過(guò)程：首先在Cas1，Cas2等蛋白的作用下，將外來(lái)DNA序列組裝到CRISPR陣列中，接著在系統(tǒng)外的RNase III或者系統(tǒng)自身效應(yīng)蛋白的作用下，完成pre-crRNA的切割，最后效應(yīng)蛋白在crRNA的引導(dǎo)下靶向目的DNA/RNA，從而發(fā)揮干擾作用。與Class 1 CRIPSR需要多個(gè)蛋白構(gòu)成效應(yīng)復(fù)合物不同，Class 2 CRISPR只需要單個(gè)效應(yīng)蛋白。根據(jù)效應(yīng)蛋白的不同，Class 2又可以進(jìn)一步分為三個(gè)不同類(lèi)型，分別是以Cas9為代表的Type II，以Cpf1為代表的的Type V和以C2c2為代表的的Type VI。

▲  CRIPSR-Cas系統(tǒng)示意圖

Class2 CRIPSR簡(jiǎn)介：Cas9，Cpf1與C2c2

CRISPR-Cas9是目前為止研究最深，應(yīng)用最廣的CRIPSR系統(tǒng)，它與后發(fā)現(xiàn)的Type V家族Cpf1都能夠靶向目的dsDNA，但是兩者相比有以下明顯不同：1. Cpf1只需要一個(gè)crRNA完成目的序列的靶向，而Cas9中需要crRNA和tracrRNA兩個(gè)分子來(lái)完成；2. Cpf1識(shí)別3’富含T的PAM序列，而Cas9識(shí)別5’富含G的PAM序列；3. 在Cas9中有HNH和RuvC兩個(gè)活性結(jié)構(gòu)域分別切割目標(biāo)DNA的互補(bǔ)鏈和非互補(bǔ)鏈，而在Cpf1中一個(gè)全新的活性結(jié)構(gòu)域Nuc，和RuvC分別切割目標(biāo)DNA的互補(bǔ)鏈和非互補(bǔ)鏈；4. Cas9在PAM臨近的位置切割DNA產(chǎn)生平末端，而Cpf1在PAM遠(yuǎn)端切割DNA產(chǎn)生突出的末端。而Type VI家族C2c2是一個(gè)RNA-guided的RNase，它含有兩個(gè)HEPN結(jié)構(gòu)域。在識(shí)別了目的RNA后，C2c2就變成了一個(gè)非特異的RNase，因此導(dǎo)致細(xì)胞毒性與程序性死亡。

▲  Class II CRISPR分類(lèi)

隨著Cas9, Cpf1, C2c2的結(jié)構(gòu)被解析，人們對(duì)于這些蛋白的機(jī)制和應(yīng)用理解更深入。CRISPR技術(shù)引領(lǐng)了一波生物技術(shù)革新，由于其精確靶向性和易操作性，Cas9和Cpf1被廣泛應(yīng)用于基因編輯于基因治療，而C2c2也能夠用于基因沉默與核酸檢測(cè)。這些技術(shù)將在下文向大家介紹。

▲  Cas9，Cpf1與C2c2的特點(diǎn)

CRISPR與基因編輯

雖然大部分Class 2 CRISPR蛋白在體外都具有切割活性，然而只有少數(shù)被證明能夠用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的編輯。此外，由PAM帶來(lái)的序列限制性，DNA特異性帶來(lái)的脫靶現(xiàn)象等，也是基因編輯中亟待解決的問(wèn)題。

▲  可用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因編輯的CRISPR酶與其PAM序列

PAM序列特異性的改造。以最常用的SpCas9為例，其PAM序列NGG在人類(lèi)基因組上平均每8-12bp就會(huì)出現(xiàn)一次，這個(gè)頻率基本能滿足經(jīng)典的HDR或者NHEJ為基礎(chǔ)的基因編輯。然而對(duì)于一些需要單個(gè)核苷酸分辨率的情況，或者如SaCas9中，PAM序列為NNGRRT，此時(shí)的PAM特異性就會(huì)成為一個(gè)重要的限制。為此，如何減少PAM的限制，擴(kuò)展Cas9的靶向范圍是非常具有意義的。

現(xiàn)在已有一些工作，通過(guò)突變Cas9蛋白的一兩個(gè)氨基酸，從而改變其PAM的特異性。野生的FnCas9的PAM序列為NGG，而E1369R/E1449H/R1556A三突變RHAFnCas9則可將PAM序列放寬至YG。通過(guò)細(xì)菌選擇系統(tǒng)篩選得到的突變體VQRSpCsa9 (D1135V/R1335Q/T1337R) 可識(shí)別PAM為NGA和NGCG，EQR SpCas9(D1135E/R1335Q/T1337R)可以識(shí)別NGAG，VRERSpCas9 (D1135V/G1218R/R1335E/T1337R)可識(shí)別NGCG。

而在SaCas9中，突變體KKH（E782K/N968K/R1015H）能夠?qū)⒃璓AM序列NNGRRT放寬到NNNRRT，而不增加SaCas9的脫靶頻率。

▲  PAM序列特異性的改造

降低脫靶效應(yīng)。作為一種基因編輯工具，脫靶效應(yīng)會(huì)產(chǎn)生大量副產(chǎn)物從而影響實(shí)驗(yàn)效率，因此如何降低脫靶效應(yīng)也是值得不斷探索的技術(shù)難題。有研究顯示，Cpf1酶的特異性比Cas9高，因此使用CRISPR-Cpf1系統(tǒng)進(jìn)行基因編輯可以降低脫靶效應(yīng)。對(duì)于SpCas9及其他Cas9，減少sgRNA與目的DNA的互補(bǔ)序列至20個(gè)bp以下，可以顯著提高Cas9的特異性。減少Cas9蛋白在細(xì)胞中的存在時(shí)間也能夠提高特異性，比如直接遞送Cas9:sgRNA核苷酸蛋白復(fù)合物（RNPs）相比于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，產(chǎn)生的脫靶效應(yīng)更少。此外使用改造的Cas9也能夠特異性。比如使用兩個(gè)單活性結(jié)構(gòu)域失活的nickase Cas9（Cas9n），分別靶向目的基因改造區(qū)域的兩側(cè)，這種方法能在保持on-target活性的基礎(chǔ)上降低幾個(gè)數(shù)量級(jí)的脫靶效應(yīng)。或者使用融合了非特異性限制內(nèi)切酶FokI的失活Cas9（dCas9），F(xiàn)okI需要二聚才能發(fā)揮功能，當(dāng)兩個(gè)dCas9分別靶向目的基因改造區(qū)域的兩側(cè)，F(xiàn)okI才能在特定位點(diǎn)發(fā)生二聚從而切割DNA。此外，使用內(nèi)含肽失活的Cas9系統(tǒng)（intein-inactivatedCas9），或者small-molecule-dimerizedsplit Cas9系統(tǒng)，能夠控制有活性Cas9的產(chǎn)生，從而降低脫靶效應(yīng)。最后通過(guò)Cas9中幾個(gè)氨基酸的突變也能夠提高DNA的特異性。在spCas9中，HF Cas9(N497A/R661A/Q695A/Q926A)與eCas9(K848A/K1003A/R1060A)能夠中和蛋白與DNA磷酸糖骨架之間的非特異性靜電作用，從而顯著提高Cas9對(duì)DNA的特異性。

▲  提高CRIPSR系統(tǒng)DNA特異性的方法

精準(zhǔn)編輯（precise editing）。由于同源依賴(lài)的修復(fù)HDR效率很低（<5%），大部分由Cas9/Cpf1產(chǎn)生的DNA雙鍵斷裂都由NHEJ修復(fù)完成，從而會(huì)引進(jìn)許多隨機(jī)的插入和缺失。此外，HDR的效率還與細(xì)胞的類(lèi)型與狀態(tài)等因素相關(guān)，因此如何提高HDR效率從而完成基因的精準(zhǔn)編輯也是CRIPSR技術(shù)用于臨床的巨大挑戰(zhàn)。

其中一個(gè)做法是使用單個(gè)Cas9n與donorDNA底物，由于DNA缺口基本不會(huì)導(dǎo)致NHEJ，因此此方法只產(chǎn)生很少的插入和缺失，但是其編輯效率與野生型相比顯著下降，且能應(yīng)用的細(xì)胞類(lèi)型也十分有限。由于HDR與NHEJ的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，使用小分子的NHEJ抑制劑或者HDR的增強(qiáng)劑也能夠提高HDR的發(fā)生頻率。DNA ligase IV的抑制劑Scr7，DNA-PKcs抑制劑，與KU70/KU80的抑制劑或者Rad51的小分子激活劑都能夠提高HDR介導(dǎo)的基因編輯頻率。此外，將細(xì)胞同步在G-phase也能夠提高HDR頻率。但是這些小分子抑制劑可能會(huì)影響細(xì)胞正常的功能，因此在實(shí)際使用中會(huì)有諸多限制。

同時(shí)在同源DNA模板上也能做一些改進(jìn)。由于切割完成后，Cas9從DNA上的解離是不對(duì)稱(chēng)的。若同源模板DNA能與最先被釋放出的DNA退火的話，HDR介導(dǎo)的基因編輯效率就會(huì)提高。為了避免完成編輯的DNA再次被Cas9識(shí)別切割，可以通過(guò)突變同源模板DNA，使得HDR產(chǎn)物形成突變的PAM。

堿基編輯（baseediting）是一種引入點(diǎn)突變的新策略，它不依賴(lài)于HDR或者DNA雙鍵斷裂。其主要方法是融合失活的Cas9（dCas9）與一個(gè)胞嘧啶脫氨酶，在dCas9，sgRNA和目的DNA互補(bǔ)鏈形成三元復(fù)合物時(shí)，胞嘧啶脫氨酶能催化非互補(bǔ)鏈（單鏈）上的C（互補(bǔ)序列3-5個(gè)堿基位置處）轉(zhuǎn)化為U，接著引發(fā)細(xì)胞錯(cuò)配修復(fù)從而將原先的C:G替換為T:A。這種方法的編輯效率比HDR介導(dǎo)的點(diǎn)突變更高，且插入缺失突變更少。但是仍存在一些不足：首先需要被編輯的C距離PAM序列特定的位置，限制了廣泛應(yīng)用；其次可能無(wú)法分辨編輯窗口中的多個(gè)C，從而特異性降低。

▲  提高精準(zhǔn)基因編輯效率的辦法

CRISPRa與CRISPRi。CRIPSR除了用于精準(zhǔn)編輯某個(gè)基因，還能用于調(diào)控基因的表達(dá)。當(dāng)將轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域VP64與dCas9:sgRNA融合，就能夠激活特定基因的表達(dá)。第二代dCas9-activator融合蛋白使用了多個(gè)拷貝的VP16，三元激活因子VPR（VP64-p65-Rta）或者串聯(lián)重復(fù)的VP64表位標(biāo)簽肽段。此外，轉(zhuǎn)錄激活因子MS2-p65-HSF1等也可以通過(guò)結(jié)合sgRNA上的RNA發(fā)卡結(jié)構(gòu)從而實(shí)現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)錄激活。同時(shí)使用dCas9-VP64與MS2-p65-HSF1，被稱(chēng)為協(xié)同激活調(diào)控（synergistic activation mediator(SAM)），展現(xiàn)出了超強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄激活能力。相反的，失活的Cas9（dCas9）本身或者dCas9融合轉(zhuǎn)錄抑制因子KRAB能夠抑制特定基因的表達(dá)。而且，上文提到過(guò)的small-molecule-activateddCas9融合VP64或KRAB，就能夠?qū)崿F(xiàn)特定基因時(shí)空特異地激活與抑制。

除了直接融合轉(zhuǎn)錄激活/抑制因子，dCas9還可以融合相關(guān)的表觀遺傳因子。如dCas9融合甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT3A使目標(biāo)DNA區(qū)域100bp范圍內(nèi)甲基化水平升高；而dCas9融合去甲基化酶Tet1能使目標(biāo)DNA 200bp范圍內(nèi)發(fā)生去甲基化。dCas9與H3K27乙?；?/span>p300或者組蛋白去甲基化酶LSD1的融合，能夠影響目的區(qū)域近千bp的組蛋白修飾變化，從而實(shí)現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。

▲  CRISPR介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄激活與抑制

基因編輯試劑的遞送（delivery）。由于相關(guān)的基因編輯試劑都是蛋白，核酸等大分子，不能夠自發(fā)地進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。此外，在血液中裸露的核酸還會(huì)被核酸酶降解從而引發(fā)免疫反應(yīng)。因此基因編輯試劑如何能克服這些障礙，從而進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮作用是實(shí)現(xiàn)體內(nèi)基因編輯的一大難題。

目前用于體內(nèi)基因編輯遞送主要有以下方法：高壓注射法（Hydrodynamicinjection ,HDI），脂質(zhì)-納米顆粒遞送（Lipidnanoparticle delivery，LNP）以及依賴(lài)病毒載體的遞送（Viraldelivery）。在老鼠乙肝病毒模型中，HDI遞送的Cas9和sgRNA質(zhì)粒能夠有效的降低乙肝病毒的表達(dá)量，但是在人臨床實(shí)驗(yàn)中，HDI的應(yīng)用被其毒性和低轉(zhuǎn)換效率所限制。利用Lipid nanoparticle，可以將純化好的Cas9:sgRNA核苷酸蛋白復(fù)合物（RNP）遞送到細(xì)胞內(nèi)。與遞送mRNA或者DNA質(zhì)粒相比，遞送RNPs中Cas9蛋白發(fā)揮活性的時(shí)間窗口更短，從而提高特異性，降低脫靶發(fā)生的頻率。目前有多項(xiàng)利用LNP技術(shù)進(jìn)行的基因編輯產(chǎn)品正在開(kāi)發(fā)之中。

▲  用于體內(nèi)基因編輯的方法

曾在90年代用于基因治療的病毒載體主要存在兩個(gè)問(wèn)題，一是質(zhì)粒被整合到了基因組中錯(cuò)誤的位置，導(dǎo)致了致癌基因的激活；而是因?yàn)椴《据d體存在的高免疫原性，引發(fā)了宿主強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，導(dǎo)致多器官功能衰竭與腦死亡。經(jīng)過(guò)了近20年的改進(jìn)，現(xiàn)在的病毒載體顯示出更高的轉(zhuǎn)化效率與更好的安全性質(zhì)?，F(xiàn)在主要使用的病毒載體包括慢病毒（lentivirus），腺病毒（adenovirus）和腺相關(guān)病毒（adeno-associatedvirus, AAV）。慢病毒是逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種，它能夠?qū)⒉《?/span>DNA整合到不分裂的細(xì)胞中。為了避免錯(cuò)誤整合而導(dǎo)致的致癌基因激活，整合酶缺陷的慢病毒載體（Integrase-defectivelentiviral vectors, IDLVs）也被開(kāi)發(fā)出來(lái)。慢病毒能夠包裝多達(dá)8.5 kb的DNA，足夠滿足Cas9，sgRNA和其他調(diào)控元件的包裝。腺病毒能夠感染分裂和不分裂期的細(xì)胞，而不整合進(jìn)基因組。然而腺病毒有很高的免疫原性可能會(huì)引發(fā)很強(qiáng)的免疫反應(yīng)。腺相關(guān)病毒來(lái)自細(xì)小病毒家族，是目前發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單的單鏈DNA缺陷型病毒。AAV也能夠感染分裂和不分裂期的細(xì)胞，而不整合進(jìn)基因組；同時(shí)由于AAV在人體中廣泛存在，所以其免疫原性也非常低。此外，由于AAV有多種血清型，它可以用于器官特異性的遞送。AAV載體所面臨的最大問(wèn)題是它的包裝限制為4.5kb，而最常用的SpCas9的大小為4.2 kb，幾乎不可能將基因編輯的所有原件組裝進(jìn)一個(gè)載體。改進(jìn)方法之一是使用更小的Cas9，如SaCas9大小為3.2 kb。另一個(gè)方法是使用兩個(gè)AAV載體分別包裝一半split-intein Cas9，當(dāng)兩個(gè)AAV載體共轉(zhuǎn)時(shí)能形成完整功能的Cas9從而進(jìn)行基因編輯。由賓夕法尼亞大學(xué)發(fā)明的AAV2.0技術(shù)授權(quán)給了REGENXBIO進(jìn)行商業(yè)化開(kāi)發(fā)，目前超過(guò)70%的臨床AAV項(xiàng)目都采用了此平臺(tái)。

▲  慢病毒，腺病毒與腺相關(guān)病毒的特點(diǎn)

CRIPSR相關(guān)公司。小編之前的文章《基因編輯能走多遠(yuǎn)：CRISPR引領(lǐng)的精準(zhǔn)醫(yī)療》中已經(jīng)詳細(xì)介紹了張鋒創(chuàng)辦的Editas Medicine；Jennifer Doudna的Intellia Therapeutics和Emmanuelle Charpentier等人聯(lián)合創(chuàng)辦的藥物研發(fā)公司CRISPR Therapeutics。其中Intellia Therapeutics主要使用的遞送方法是LNP，而Editas Medicine同時(shí)使用了LNP和AVV兩種方法。在中國(guó)，華西醫(yī)院率先開(kāi)展世界首個(gè)CRISPR臨床試驗(yàn)。試驗(yàn)采用ex vivo的方法，利用CRISPR技術(shù)敲除患者T細(xì)胞中的PD-1，用于治療用于治療非小細(xì)胞肺癌。這次臨床試驗(yàn)主要是為了檢測(cè)這項(xiàng)療法的安全性，希望能早日看到該實(shí)驗(yàn)的進(jìn)展。

CRISPR與靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)

 CRIPSR/Cas9除了直接用于基因編輯，也能夠用于藥物靶點(diǎn)的大規(guī)模篩選?，F(xiàn)有的shRNA文庫(kù)篩選存在兩個(gè)缺點(diǎn)：一是RNAi不能夠做到完全knockdown，因此會(huì)有很多假陰性；二是RNAi脫靶頻率高，會(huì)導(dǎo)致很多的假陽(yáng)性。CRISPR技術(shù)可以減少這些干擾，同時(shí)由于sgRNA序列一般比較短，可以實(shí)現(xiàn)高通量的array-based寡核苷酸合成，從而構(gòu)建sgRNA文庫(kù)。CRISPRi LOF（loss-of-function）文庫(kù)與CRISPRa GOF（gain-of-function）文庫(kù)都可以以細(xì)胞生長(zhǎng)為指標(biāo)，大規(guī)模地分析癌細(xì)胞中的遺傳依賴(lài)關(guān)系。此外，在加入某藥品的情況下進(jìn)行篩選，可以分析該藥物產(chǎn)生耐藥性的機(jī)制。比如在黑色素瘤細(xì)胞系A375中進(jìn)行BRAF抑制劑vemurafenib的耐藥性篩選發(fā)現(xiàn)，腫瘤抑制因子NF2，culin E3連接酶CUL3以及一些組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶STAGA復(fù)合物成員的缺失，會(huì)導(dǎo)致vemurafenib耐藥性產(chǎn)生。

▲  利用CRISPRi和CRISPRa進(jìn)行高通量的藥物靶點(diǎn)篩選

同樣的，CRISPR也能夠用于最近異常火爆的“協(xié)同致死（synthetic lethality）”基因的篩選。最近《Nature Methods》上發(fā)表了Trey Ideker和Prashant Mali教授的工作，他們利用CRISPR技術(shù)，在HeLa，A549和293T三個(gè)細(xì)胞系中，發(fā)現(xiàn)73個(gè)癌基因與藥物靶點(diǎn)之間，存在著152對(duì)協(xié)同致死效應(yīng)組合。其中包括28對(duì)也被證實(shí)的組合，如BRCA1-PARP1和PTEN-MTOR。通過(guò)藥物進(jìn)一步確認(rèn)，這個(gè)結(jié)果的準(zhǔn)確精確性在75%以上，因此能用于大規(guī)模篩選協(xié)同致死基因。Dual-gRNA文庫(kù)是通過(guò)array-based寡核苷酸合成建立的，涵蓋了10萬(wàn)多組基因組合。因此每個(gè)構(gòu)建包含兩個(gè)gRNA，靶向兩個(gè)目的基因，根據(jù)其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響從而判斷兩個(gè)基因之間的遺傳關(guān)系。在所有的152對(duì)組合中只有16組（10.5%）是其中兩個(gè)細(xì)胞系共有的，而且不存在三個(gè)細(xì)胞系共有的組合。這說(shuō)明了協(xié)同致死效應(yīng)存在著細(xì)胞特異性。

▲  CRISPR方法篩選協(xié)同致死基因組合

C2c2與與核酸檢測(cè)

Type VI家族的C2c2于2016年被報(bào)道，與Cas9和Cpf1切割雙鏈DNA不同，C2c2是一個(gè)RNA-guided的ssRNA切割酶。當(dāng)時(shí)作者提出C2c2可以用于核酸檢測(cè)，在今年4月的《Science》上，張峰課題組帶來(lái)了C2c2的重磅應(yīng)用，用于檢測(cè)核酸，其靈敏度可達(dá)到阿摩爾級(jí)（aM, 10的負(fù)18次方摩爾每升），甚至有望檢測(cè)出單個(gè)核酸，這對(duì)于某些診斷的應(yīng)用有著重要意義。為了得到更為靈敏的信號(hào)，選擇了RNase活性更強(qiáng)的LwC2c2。同時(shí)為了進(jìn)一步提高檢測(cè)靈敏度，也使用了“等溫?cái)U(kuò)增”（isothermal amplification）技術(shù)。待檢DNA經(jīng)重組聚合酶（recombinase polymeraseamplification, RPA）擴(kuò)增后再經(jīng)T7轉(zhuǎn)錄為RNA，當(dāng)LwC2c2識(shí)別這RNA后，就可以發(fā)揮非特異的RNase活性，從而將系統(tǒng)里添加的RNA熒光探針切開(kāi)，釋放出熒光。此方法的靈敏度達(dá)到了單分子級(jí)別，且能夠用于癌癥液體活檢等。由于這套系統(tǒng)中的成分都可以采用凍干粉的方法保存，有利于實(shí)現(xiàn)這套系統(tǒng)的商業(yè)化。

▲  C2c2用于核酸檢測(cè)示意圖

爭(zhēng)議！CRISPR的脫靶效應(yīng)

雖然上文已經(jīng)介紹過(guò)多種方法用于降低CRISPR的脫靶效應(yīng)，但是今年5月《Nature Methods》上發(fā)表了一篇論文，文章發(fā)現(xiàn)在在小鼠的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，CRISPR技術(shù)會(huì)引入數(shù)百種意料外的基因突變。研究者們對(duì)兩只接受了CRISPR基因編輯的小鼠和一直未接受編輯的小鼠進(jìn)行了全基因組測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩只小鼠中都出現(xiàn)了100多種插入/缺失突變，而對(duì)照組小鼠只有3-4種。令人詫異的是在兩只小鼠中，有68%的突變是兩者共有的，且這些突變的基因組序列與sgRNA序列之間的同源性并不高。這篇研究迅速成為了整個(gè)生物圈關(guān)注的熱點(diǎn)，也有科學(xué)家對(duì)此結(jié)果提出了質(zhì)疑。Editas Medicine的首席技術(shù)官Vic E. Myer與著名科學(xué)家GM Church聯(lián)合發(fā)文，他們認(rèn)為研究的數(shù)量非常有限，可能會(huì)限制觀察統(tǒng)計(jì)的重現(xiàn)性和可靠性。此外作者不能排除實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和單個(gè)對(duì)照之間報(bào)告的基因組差異在CRISPR實(shí)驗(yàn)操作之前存在的可能性。

任何技術(shù)的發(fā)展總會(huì)遇到波折，希望這樣的學(xué)術(shù)探討能夠促進(jìn)對(duì)CRISPR技術(shù)特異性的理解，使得CRISPR藥物早日進(jìn)入市場(chǎng)，造福人類(lèi)。

參考文獻(xiàn)

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• CRISPR/Cas9:From Genome Engineering to Cancer Drug Discovery, Trends in Cancer, 2016

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• Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2, Science, 2017

• CRISPR gene editing can cause hundreds of unintended mutations, Nature Methods, 2017