CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)實在太強大，確實可以想盡各種辦法去“玩”，從基因敲除、基因插入、單堿基基因編輯、大片段基因敲除到RNA編輯等，似乎只有你想不到?jīng)]有做不到的。然而或許有人會問，CRISPR/Cas9能敲除整條染色體嗎？聽起來覺得還有點距離，然而11月25日，Genome Biology雜志上就發(fā)表了由中科院神經(jīng)科學研究所、腦科學與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心楊輝研究組與北京大學胡家志實驗室合作完成的題為“CRISPR/Cas9-mediated targeted chromosome elimination”的研究論文，該研究介紹了CRISPR/Cas9技術(shù)、在細胞、胚胎或體內(nèi)組織中，針對目標染色體進行多個DNA剪切，可以選擇性消除單條染色體。這項技術(shù)為動物模型的建立以及非整倍體疾病的治療提供了新的方法。

楊輝研究員自回國在中科院神經(jīng)所建立實驗室以來，主要從事基因CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的應用研究病著手建立基因修飾猴的許多疾病模型，致力于各種CRISPR相關(guān)工具的開發(fā)及優(yōu)化，包括CRISPR激活系統(tǒng)、CRISPR標記系統(tǒng)和CRISPR介導的成體治療等等。同時，異種嵌合動物的高效制作和應用也是該實驗室的一個新興方向。

楊輝實驗室成立于2014年，積累了短短三年之后，在今年連續(xù)發(fā)表了多項研究成果。其中，今年5月和6月發(fā)表了兩篇Cell Research論文，其中一項工作建立了一種新的基于HMEJ的靶向精確整合策略，即利用帶有單個向?qū)NA（sgRNA）靶向位點和長同源臂（約800bp）的供體載體來實現(xiàn)高效的精確整合【1】（與施霖宇團隊、孫強團隊合作完成）；另一項工作則是通過將多個針對基因外顯子的連續(xù)指導RNA（sgRNA）注射到受精卵中，可以高通量制作各種基因完全敲除小鼠并用于表型分析，并快速制作基因敲除猴模型【2】（與熊志奇研究組以及孫強團隊合作完成）。

在最新的這項研究中，研究人員為了利用CRISPR/Cas9實現(xiàn)整條染色體的基因敲除，他們首先應用CRISPR/Cas9介導的針對Y染色體的多位點DNA切割可以有效地將小鼠胚胎干細胞的Y染色消除。這種多位點剪切可通過單個sgRNA靶向結(jié)合多個特異的染色體位點，或者通過14個sgRNA分別結(jié)合各自的特異位點來達到。此外，他們還發(fā)現(xiàn)小鼠X染色體，人的7號和14號染色體都可以通過這種方法消除。更為重要的是，唐氏綜合癥病人的iPS細胞中的21號染色體也可以通過這種方法特異性消除。因此，該研究第一次證明性染色體和常染色體可以通過基因編輯特異性消除。

圖為用CRISPR/Cas9介導的Y染色體敲除獲得特納綜合征小鼠。a. Y染色體基因靶向位點示意圖。b. 實驗設(shè)計。將Cas9 mRNA和2個特異靶向Rbmy1a1，Ssty1, Ssty2或Kdm5d基因的sgRNAs分別注射到小鼠受精卵。c. 所獲小鼠的性別比例。d. 12周的XO小鼠。e. XO小鼠的DNA FISH結(jié)果。

或許讀者會問，這項技術(shù)有何應用前景？難道只是為了“炫酷”？

當然不是為了炫酷了。實際情況是這樣的，人類遺傳性疾病中有一類是由于染色體的非整倍性造成的，比如我們熟知的唐氏綜合征（多了一條21號染色體）和Klinefelter綜合征（比正常男性多了1條X染色體，因此又稱為47-XXY綜合征。患者有類無睪身材、男性乳房發(fā)育、小睪丸、無精子及尿中促性腺激素增高等）。另外，許多腫瘤中也存在許多非整倍性的染色體。因此，利用CRISPR/Cas9介導的染色體去除技術(shù)為治療非整倍性疾病提供了一種潛在的可能，雖然看起來離應用還有很長一段時間。

這項技術(shù)的原理簡單來說就是，設(shè)計多條sgRNA破壞單一染色體上在多個位點都存在的重復序列，理論上一條染色體有許許多多重復的序列，如果用CRISPR/Cas9剪刀在這樣的序列上反復的剪切，最后連體內(nèi)的修復機器也沒法修補，那么多次剪切后的染色體理論上不再能很好的發(fā)揮生物學效應。

據(jù)楊輝博士透露，這項技術(shù)目前的主要挑戰(zhàn)在于如何大量引入多個DNA切割。不同的重復序列之間的染色體去除效率不同，并且很難去預測這些重復序列是否工作的很好。另外一個挑戰(zhàn)就是如何選擇性的去靶向兩條或三條同源染色體中的特定一條染色體。

最后值得一提的是，據(jù)楊輝博士在朋友圈透露，這是該實驗室目前經(jīng)歷時間最長的paper，也經(jīng)歷了不少坎坷。不過，筆者想說的是，實驗室才建立了3年，其實也不算長嘛。且不說已經(jīng)發(fā)了兩篇Cell Research和一篇EBio Medicine，都是研究性論文【1,2,3】。

據(jù)悉，楊輝研究員和胡家志研究員為本文的共同通訊作者，左二偉、霍小娜、姚璇、胡新德、孫怡迪和尹健行為論文的共同第一作者。

參考文獻：

1、Yao, X., Wang, X., Hu, X., Liu, Z., Liu, J., Zhou, H., Shen, X., Wei, Y., Huang, Z., Ying, W., Wang, Y., Nie, Y. H., Zhang, C. C., Li, S., Cheng, L., Wang, Q., Wu, Y., Huang, P., Sun, Q.#, Shi, L.#, Yang, H.# (2017). Homology-mediated end joining-based targeted integration using CRISPR/Cas9. Cell Res. 27, 801-814.

2、Zuo, E., Cai, Y.J., Li, K., Wei, Y., Wang, B.A., Sun, Y., Liu, Z., Liu, J., Hu, X., Wei, W., Huo, X., Shi, L., Tang, C., Liang, D., Wang, Y., Nie, Y. H., Zhang, C. C., Yao, X., Wang, X., Zhou, C., Ying, W., Wang, Q., Chen, R. C., Shen, Q., Xu, G. L., Li, J. Sun, Q.#, Xiong, Z.#, Yang, H.# (2017). One-step generation of complete gene knockout mice and monkeys by CRISPR/Cas9-mediated gene editing with multiple sgRNAs. Cell Res.27:933-945

3、Yao, X., Wang, X., Liu, J., Hu, X., Shi, L., Shen, X., Ying, W., Sun, X., Wang, X., Huang, P.#, Yang, H.# (2017). CRISPR/Cas9 - Mediated Precise Targeted Integration In Vivo Using a Double Cut Donor with Short Homology Arms. EBio Medicine.