|
內(nèi)參蛋白是用來確保蛋白上樣量一致性，量化目的蛋白的表達情況，是免疫印跡（WB）和免疫熒光（IF）等實驗結(jié)果定量分析或定性比較的重要標(biāo)尺。 如何選擇內(nèi)參蛋白？ 內(nèi)參蛋白主要是一些持家基因，這些持家基因執(zhí)行大量的基本功能，并持續(xù)在多種組織和細胞中高水平表達。 常見內(nèi)參蛋白包括 Actin、Tubulin、GAPDH、Histone H3 等。 但是，研究不同類型的蛋白，對內(nèi)參的選擇是有講究的，如： 1. 胞漿蛋白的內(nèi)參與胞核蛋白的內(nèi)參是不一樣的； 2. 在一定的實驗條件下，內(nèi)參蛋白的表達發(fā)生明顯的變化時需要選擇其他表達不變或者變化很小的蛋白； 3. 當(dāng)研究的蛋白的分子量與內(nèi)參接近時，需要選擇分子量與目的蛋白的分子量差距比較大的蛋白。 以下這張圖歸納了不同細胞組分對應(yīng)的內(nèi)參及其分子量，掌握了這張圖，內(nèi)參選擇不再難?？靹觿幽愕氖种甘詹仄饋戆?。 上圖來自 CST Guide 科研寶典：《CST Guide: Pathways & Protocols》 多數(shù)情況下，內(nèi)參蛋白的表達量很高且穩(wěn)定，但是，特定的實驗條件（環(huán)境壓力，外界因素刺激等）會引起這些內(nèi)參蛋白的變化，因此有些內(nèi)參在不同實驗條件或研究模型下不適合選擇，我們總結(jié)了最近研究的結(jié)果，列出有些實驗條件下不合適的內(nèi)參供參考：
1. 研究結(jié)腸癌的發(fā)生及轉(zhuǎn)移時，細胞骨架蛋白 Vinculin 不適合做全細胞的內(nèi)參。近期研究表明，結(jié)腸癌中 Vinculin 表達的減少和增加與致癌和轉(zhuǎn)移有關(guān)聯(lián)1。
2. 在環(huán)境壓力下，HSP70 和 HSP90 被誘導(dǎo)而表達發(fā)生變化，盡管 HSP70 和 HSP90 正常情況下是組成性表達的分子伴侶，能夠保持蛋白合成穩(wěn)態(tài)，但環(huán)境壓力下，HSP70 和 HSP90 不適合胞漿蛋白的內(nèi)參2。
3. 當(dāng)細胞發(fā)生凋亡的時候，核多聚 (ADP-核糖) 聚合酶 PARP 和核膜的結(jié)構(gòu)組分 Lamins，都不適合做核蛋白的內(nèi)參。在凋亡細胞體內(nèi)，PARP 是 caspase-3 裂解的主要靶蛋白之一3。 Lamin A/C 能夠被 caspase-6 切割，可以作為 caspase-6 激活的標(biāo)志。在凋亡過程中，Lamin A/C 能夠被特異地剪切成大片段 (41-50 kDa) 和小片段 (28 kDa)。Lamin 的剪切會引起細胞核的失調(diào)和細胞死亡4,5。
4. VDAC (電壓依賴性陰離子通道) 廣泛表達，定位于線粒體外膜，通常認為這是代謝傳入或傳出線粒體的主要方式。另外，這個通道在凋亡信號中發(fā)揮重要作用。 Bcl-2 家族蛋白調(diào)控凋亡過程中線粒體通透性的改變，他們能結(jié)合 VDAC 改變通道的動力6。VDAC 的同二聚體化可能是一種改變線粒體通透性和促進細胞色素 C 釋放的機制。 5. Cofilin 屬于一組保守的小 Actin-結(jié)合蛋白家族，在胞質(zhì)分裂，內(nèi)吞，胚胎發(fā)育，壓力應(yīng)激和組織再生過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。在刺激因素作用下，Cofilin 作為提前存在的細絲促進 Actin 肌動蛋白絲的再生7。Cofilin 的第 3 位絲氨酸被 LIMK 或 TESK 磷酸化后會抑制 Cofilin 的這種作用8。 6. Actin ，一種廣泛表達的真核蛋白，是細胞骨架的重要組分。研究證明在原始乳腺癌細胞中 Actin 是高度磷酸化的9。研究也發(fā)現(xiàn)凋亡條件下，心臟肌肉以及骨骼肌中都能觀察到 beta-Actin 的清除10，因此，beta-Actin 不適用于心臟和骨骼肌的樣品。心肌和骨骼肌樣本可以用 alpha-Actin 做內(nèi)參。 Caspase-3 對 Actin 的清除會加速泛素/蛋白酶體依賴的肌肉蛋白酶解11。 細胞生長條件的改變以及與胞外基質(zhì)組分的相互作用都可能會導(dǎo)致 Actin 蛋白合成的變化 。
7. GAPDH（甘油醛－3－磷酸脫氫酶）, 在糖酵解過程中將 3-磷酸甘油醛進一步磷酸化。雖然在不同組織中的表達水平有差異，但 GAPDH 普遍被認為是一個組成型表達的持家蛋白。正是由于這個原因，GAPDH 的 mRNA 和蛋白通常在對其它有變化的靶蛋白測定實驗時作為對照。當(dāng)代謝信號通路受到影響時 GAPDH 不適合做內(nèi)參等。 8. 球形微管蛋白亞基包含微管建筑塊，由 α/β-tubulin 異源二聚體形成所有真核細胞的 tubulin 亞單位。 對抗微生物和抗有絲分裂藥物耐受性的不同而會導(dǎo)致 Tubulin 的表達發(fā)生變化 。 為了滿足你各種實驗的需要，CST 為您準(zhǔn)備了含優(yōu)選貨號的內(nèi)參 Sampler kit，性價比高，購買方便。 #4670 Loading Control Antibody Sampler Kit (HRP Conjugate) #5142 Loading Control Antibody Sampler Kit #9774 Loading Control Antibody Sampler Kit (Mouse) 內(nèi)參相關(guān)產(chǎn)品
參考文獻 1. Yang, H.J. et al. (2010) Cancer Invest 28, 127-34. 2. Nollen, E.A. and Morimoto, R.I. (2002) J. Cell Sci. 115, 2809-2816. 3. Tewari, M. et al. (1995) Cell 81, 801-809. 4. Oberhammer, F.A. et al. (1994) J Cell Biol 126, 827-37. 5. Rao, L. et al. (1996) J Cell Biol 135, 1441-55. 6. Shimizu, S. et al. (1999) Nature 399, 483-7. 7. Condeelis, J. (2001) Trends Cell Biol 11, 288-93. 8. Toshima, J. et al. (2001) J Biol Chem 276, 31449-58. 9. Lim, Y.P. et al. (2004) Clin. Cancer Res. 10, 3980-3987. 10. Communal, C. et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 6252-6256. 11. Du, J. et al. (2004) J. Clin. Invest. 113, 115-123. 文章來源：CST |
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
|
來自： 美美兒科學(xué) > 《待分類》
