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細(xì)胞轉(zhuǎn)染的不同方法

 實(shí)驗(yàn)專家 2017-09-11

1.DEAE-葡聚糖。這是早在1965年出現(xiàn)的轉(zhuǎn)染方法。帶正電的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚體可以結(jié)合帶負(fù)電的DNA分子,使得DNA復(fù)合物結(jié)合在帶負(fù)電的細(xì)胞表面。通過使用DMSO或甘油獲得的滲透休克,也可能是細(xì)胞內(nèi)吞作用使得DNA復(fù)合體進(jìn)入細(xì)胞。DEAE-葡聚糖僅限于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染,可重復(fù)性好,轉(zhuǎn)染時(shí)要除掉血清。

 

2.磷酸鈣共沉淀轉(zhuǎn)染。最早在1973年開始采用。氯化鈣+DNA+磷酸緩沖液按一定的比例混和,形成極小的磷酸鈣-DNA復(fù)合物沉淀黏附在細(xì)胞膜表面,借助內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。沉淀顆粒的大小和質(zhì)量對于轉(zhuǎn)染的成功至關(guān)重要。pH值、鈣離子濃度、DNA濃度、沉淀反應(yīng)時(shí)間、細(xì)胞孵育時(shí)間乃至各組分加入順序和混合的方式都可能對結(jié)果產(chǎn)生影響,重復(fù)性不佳。此法較易得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,但轉(zhuǎn)染原代細(xì)胞比較困難。

 

3. 電穿孔法。通過短暫的高電場電脈沖處理細(xì)胞,沿細(xì)胞膜的電壓差異會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜的暫時(shí)穿孔。DN被認(rèn)為是穿過孔擴(kuò)散到細(xì)胞內(nèi)的。電脈沖和場強(qiáng)的優(yōu)化對于成功的轉(zhuǎn)染非常重要,因?yàn)檫^高的場強(qiáng)和過長的電脈沖時(shí)間會(huì)不可逆地傷害細(xì)胞膜而裂解細(xì)胞。理論上說電穿孔法可用于各種細(xì)胞,且不需要另外采購特殊試劑,但需要昂貴的電轉(zhuǎn)儀。此法每次轉(zhuǎn)染需要更多的細(xì)胞和DNA,因?yàn)榧?xì)胞的死亡率高。每種細(xì)胞電轉(zhuǎn)的條件都需要進(jìn)行多次優(yōu)化。

 

4. 脂質(zhì)體法。中性脂質(zhì)體是利用脂質(zhì)膜包裹DNA,借助脂質(zhì)膜將DNA導(dǎo)入細(xì)胞膜內(nèi)。帶正電的陽離子脂質(zhì)體則不同,DNA并沒有預(yù)先包埋在脂質(zhì)體中,而是帶負(fù)電的DNA自動(dòng)結(jié)合到帶正電的脂質(zhì)體上,形成DNA-陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物,從而吸附到帶負(fù)電的細(xì)胞膜表面經(jīng)過內(nèi)吞被導(dǎo)入細(xì)胞。脂質(zhì)體法始于1987年,此法的出現(xiàn)使得轉(zhuǎn)染效率、轉(zhuǎn)染的穩(wěn)定性和可重復(fù)性大大提高。陽離子脂質(zhì)體細(xì)胞毒性相對較高,對不同的細(xì)胞可能會(huì)干擾細(xì)胞的代謝。

 

5. 病毒介導(dǎo)的感染。感染需要將目的基因克隆到特定的病毒體系中,經(jīng)過包裝細(xì)胞的包裝得到改造后的病毒,再進(jìn)行感染。優(yōu)點(diǎn)是轉(zhuǎn)染效率特別高,尤其是難以轉(zhuǎn)染的原代細(xì)胞、活體細(xì)胞。缺點(diǎn)是構(gòu)建病毒周期長,環(huán)節(jié)多,易出錯(cuò),費(fèi)用也高。

 

6,非脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 。最新的納米聚合物轉(zhuǎn)染試劑,如Entranster試劑,納米材料,細(xì)胞毒性小,轉(zhuǎn)染效率高,漸漸成為各大實(shí)驗(yàn)室的首選轉(zhuǎn)染試劑。

 

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