如果醫(yī)生想深入了解腫瘤，他們的選擇很有限。他們可以掃描相關(guān)區(qū)域、采集組織活檢，或監(jiān)控血液的標志物，如PSA或CA 125。不過，這些都不太理想：成像的分辨率不高，活檢是侵入性的，而良好的標志物是少之又少。

最理想的情況是，研究人員能通過簡單的血液檢測來實現(xiàn)組織活檢的敏感性和特異性。如今，液體活檢的出現(xiàn)，讓這一切成為可能。

液體活檢

據(jù)斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院的助理教授Max Diehn介紹，就傳統(tǒng)的癌癥標志物而言，普遍的問題是特異性。“對于之前探索的大多數(shù)生物標志物，正常細胞也會產(chǎn)生，因此并不是腫瘤細胞所獨有的。這意味著，它們往往不是很特異?！币后w活檢則通過搜索血液及其他體液中更加特異的腫瘤指紋，來克服這方面的缺陷。

這些指紋有兩種形式：循環(huán)腫瘤細胞（CTC）是從腫瘤上脫落的活細胞，可能代表了轉(zhuǎn)移的種子；循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）則是來自死細胞的遺傳物質(zhì)，通常以DNA短片段的形式存在。Diehn實驗室最近介紹了一種檢測非小細胞肺癌患者血液中的ctDNA的方法，這些片段的平均長度為170 bp 。

當然，正常細胞也存在于血液中，而且每天都有正常細胞死亡。因此，無論研究人員是尋找CTC還是ctDNA，他們都必須慧眼識珠。對于CTC，這通常是借助細胞表型來實現(xiàn)的，如利用Janssen Diagnostics的CELLSEARCH分析，它根據(jù)上皮細胞標志物的表達來選擇細胞。

對于ctDNA，研究人員必須根據(jù)它們的序列來挑出片段，這是個艱巨的任務(wù)，因為沒突變的DNA不能提供信息。因此，這項技術(shù)適用于突變已知的情況。例如，Diehn開始鑒定NSCLC患者中常常突變的基因組區(qū)域，生成CAPP-Seq selector文庫。這個寡核苷酸集合代表了139個基因的521個外顯子和13個內(nèi)含子。研究小組利用它來收集血漿中的互補DNA片段，并以高覆蓋度測序。

根據(jù)2014年約翰霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院的研究，ctDNA可在各類腫瘤患者的血漿或血清中發(fā)現(xiàn)，不過隨著腫瘤位置和分期的不同，分析的敏感性也有差異?！?5%的晚期胰腺癌、卵巢癌、大腸癌、膀胱癌、胃癌、乳腺癌等癌癥患者中可檢測到ctDNA，不過對于原發(fā)性腦癌、腎癌、前列腺癌或甲狀腺癌，檢測率不到50%，”作者寫道。

約翰霍普金斯大學(xué)的腫瘤學(xué)教授Nickolas Papadopoulos表示，研究人員可以通過靠近源頭來實現(xiàn)更高的敏感性，比如，在檢查泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤時檢測尿液，或在檢查頭頸部癌癥時檢測唾液。實際上，研究小組最近發(fā)現(xiàn)通過腦脊液檢查，使得中樞神經(jīng)系統(tǒng)的腫瘤檢測有所改善。

如同許多ctDNA研究一樣，霍普金斯的團隊也使用靶向測序來檢測ctDNA。在這種情況下，一種稱為Safe-SeqS的條形碼策略可準確報告樣本中的ctDNA分子數(shù)量。研究人員也可以利用數(shù)字PCR來定量具體的變化，不過有的作者指出，“數(shù)字PCR分析提供了高的準確性和靈敏度，但需要個性化分析的設(shè)計，這是限速步驟”。

有利有弊

研究人員檢測癌癥患者的血液及其他體液中的ctDNA，使其成為一種有潛力的生物標志物。然而，據(jù)Papadopoulos介紹，ctDNA不僅僅是指標，似乎還與“腫瘤負荷”有關(guān)，其水平隨疾病嚴重程度而升高。此外，一些早期的癌癥也能檢測到ctDNA，表明不僅可使用ctDNA來監(jiān)控現(xiàn)有的癌癥，還能作為篩查工具。

美國國家癌癥研究所淋巴治療科的科長Wyndham Wilson表示，ctDNA還能用于預(yù)測腫瘤的復(fù)發(fā)。在一項彌漫性大B細胞淋巴瘤的研究中5，ctDNA能夠在CT掃描前幾個月就發(fā)現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)。因此，醫(yī)生能夠更早治療患者，改善他們的長期預(yù)后。

然而，ctDNA作為篩查工具，也面臨一些潛在的問題。目前還不清楚ctDNA在不同的癌癥類型、分期和患者中的普遍程度。即使檢測到ctDNA，也不清楚是體內(nèi)哪里產(chǎn)生的，或者即使檢測到的突變與腫瘤存在一定關(guān)聯(lián)，也需要后續(xù)檢測。

相比之下，CTC分析能提供基因組完整的活細胞。因此，研究人員可分離出這些細胞，在顯微鏡下觀察它們，并研究每個細胞的基因組和蛋白表達。Aviva Biosciences公司的研發(fā)副總裁

Antonio Guia認為，這帶來了比ctDNA分析更廣譜的方法，因此你不必看特定基因的特定片段。

最近，哈佛大學(xué)的Daniel Haber及其同事就開展了一些研究，利用單細胞RNA-Seq來鑒定單個前列腺癌CTC的信號差異，并將這些差異與治療反應(yīng)相關(guān)聯(lián)6。研究小組利用一種稱為CTC-iChip的微流體設(shè)備來分離CTC，它根據(jù)CD45或CD66的表達將CTC與其他血細胞分離。

不過，對于液體活檢而言，問題并不在于選擇CTC還是ctDNA。Janssen Diagnostics的首席醫(yī)療官Jorge Villacian認為，兩種標志物能提供互補的信息，作為臨床工具都有市場。這家公司專注于CTC診斷。

“腫瘤醫(yī)生以及監(jiān)管部門對液體活檢的概念了解得越多，對每個人都是雙贏的 – 對患者、對醫(yī)生以及對制度本身，因為這將使得發(fā)病率更低、并發(fā)癥更少，并改變早期治療，對患者有利?！?br>

小知識：ctDNA是什么

癌細胞在破裂和死亡時，會釋放出循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）等內(nèi)容物，這種ctDNA是飄浮在血液中的基因組片段。細胞殘骸一般由清道夫細胞（如巨噬細胞）清除，然而腫瘤很大細胞增殖又很快，導(dǎo)致清道夫細胞應(yīng)付不過來。

對血液中的腫瘤DNA進行檢測和測序，可以幫助人們通過取血得到更全面的癌癥信息，告訴醫(yī)生治療是否已經(jīng)起作用，腫瘤有沒有演化出抗性。

當然這一技術(shù)的應(yīng)用也面臨著一些問題。舉例來說，不同人的ctDNA水平差異較大，而且ctDNA并不那么容易檢測，特別是在腫瘤的早期階段。另外，人們還需要在更大型的研究中進行驗證，看ctDNA是否給出了足夠準確的信息。

如果能夠克服上述障礙，醫(yī)生們將能根據(jù)ctDNA進行更好的治療，隨著癌癥的演化調(diào)整治療策略，Johns Hopkins大學(xué)的Victor Velculescu說?！斑@種技術(shù)可以幫助人們最終實現(xiàn)個性化醫(yī)療，為癌癥領(lǐng)域帶來一場新的變革?！?/div>

ctDNA發(fā)展簡史

1948年科學(xué)家們首次發(fā)現(xiàn)人體血液中存在著循環(huán)DNA，癌癥患者的循環(huán)DNA則發(fā)現(xiàn)于1977年。在那之后又過了17年，人們才發(fā)現(xiàn)這些DNA含有癌癥的標志性突變，說明它們來自于腫瘤。

最開始，循環(huán)DNA的實際應(yīng)用并不在癌癥領(lǐng)域。鑒于腫瘤DNA會流入血液，香港中文大學(xué)的盧煜明（Dennis Lo）教授推測胎兒DNA應(yīng)該也能進入血液。1997年他向人們成功展示，孕婦血液中攜帶著男性胎兒的Y染色體。這一發(fā)現(xiàn)允許醫(yī)生們在懷孕初期通過無創(chuàng)方式檢測胎兒的性別，甚至篩查唐氏綜合癥等發(fā)育疾病。這是產(chǎn)前診斷領(lǐng)域的一次革命。

“癌癥研究后來才跟上進度，”英國癌癥研究所Nitzan Rosenfeld說。這是因為腫瘤DNA比胎兒DNA更難檢測，而且早期的測序技術(shù)還不夠準確可靠。

近十年來隨著技術(shù)的進步，DNA檢測技術(shù)已經(jīng)足夠靈敏。舉例來說，BEAMing擴增法可將循環(huán)DNA連在磁珠上，然后進行分離和計數(shù)。即使健康細胞DNA與ctDNA的比值達到10,000：1，BEAMing擴增法也可以有效檢測出ctDNA來。

BEAMing擴增法是JohnsHopkins大學(xué)的Bert Vogelstein和Kenneth Kinzler開發(fā)的。2007年，他們用這一技術(shù)對18名腸癌患者的ctDNA進行了跟蹤。手術(shù)后這些患者的ctDNA水平下降了99%，其中許多患者的ctDNA并沒有完全消失。研究顯示，手術(shù)后仍檢測得到ctDNA的患者，基本上都出現(xiàn)了癌癥復(fù)發(fā)。但手術(shù)后沒有檢測到ctDNA的患者，腸癌并沒有復(fù)發(fā)。

這說明ctDNA能夠展現(xiàn)患者對手術(shù)的應(yīng)答情況，告知醫(yī)生他們是否需要進行化療。研究者們很快也在其他癌癥類型中得到了類似的結(jié)果。Rosenfel等人發(fā)現(xiàn)，ctDNA能夠提供晚期卵巢癌和乳腺癌的準確信息。而Diaz等人在至少75%的晚期腫瘤患者中檢測了ctDNA，涉及了多種器官，比如胰腺、膀胱、皮膚、胃、食道、肝臟和頭頸。（腦癌除外，因為血腦屏障使腫瘤DNA無法進入血液。）

ctDNA有何優(yōu)勢

循環(huán)DNA將比人們幾十年來鑒定的蛋白指標更加好用，因為ctDNA檢測很少有假陽性。此外，ctDNA半衰期只有不到兩小時，而絕大多數(shù)蛋白指標能在血液中存在幾個星期，可見ctDNA能更清晰的反映腫瘤的當前信息。有研究表明，在檢測乳腺癌和腸癌時，ctDNA比蛋白質(zhì)指標更靈敏，還可以跟蹤腫瘤的消失、擴散和復(fù)發(fā)。

血液中的循環(huán)腫瘤細胞也是癌癥研究的一大熱點。不過，ctDNA比循環(huán)腫瘤細胞還要靈敏，數(shù)量也更多，更適合成為癌癥的生物學(xué)指標。

ctDNA的最大優(yōu)勢在于，能夠?qū)δ[瘤的演化和適應(yīng)性改變進行監(jiān)控。這樣的研究可以回答許多困擾科學(xué)家多年的問題，比如，為何那么多靶向性治療都以失敗告終，癌癥是怎樣發(fā)展出抗性的等等。

EGFR在細胞生長和分裂中起到了重要的作用，在癌細胞中特別活躍。Gefitinib和panitumumab是阻斷EGFR的抗癌藥物，這些藥物起初都能有效治療患者。但幾個月后，癌癥就會通過其他基因突變（例如KRAS）對它們產(chǎn)生抗性。

要監(jiān)控患者的癌癥發(fā)展，醫(yī)生們目前得進行多次活檢，以決定下一步的治療策略。然而癌癥晚期患者通常有好幾個需要檢測的腫瘤，單個腫瘤中也可能存在不同的抵抗機制。更重要的是，活檢有一定的風險性，難以用于肺部等脆弱的器官。相比之下，血檢就容易多了。

2012年，Diaz研究團隊對接受EGFR抑制劑治療的患者進行ctDNA分析。他們發(fā)現(xiàn)了42種與癌癥抗性有關(guān)的KRAS突變，利用這些突變可以比傳統(tǒng)方法早五個月發(fā)現(xiàn)腫瘤的變化。Rosenfeld團隊則收集了六名晚期乳腺癌、肺癌和卵巢癌患者的血樣，并且進行了完整的外顯子組測序。他們由此揭示了癌癥抗性的發(fā)展路徑，例如癌細胞出現(xiàn)突變，阻止藥物與其目標結(jié)合。

如果醫(yī)生們能夠及時發(fā)現(xiàn)癌癥的抗性，就可以早點停用已經(jīng)不起作用的昂貴藥物。研究癌癥抗性背后的突變，還有助于開發(fā)更有效的癌癥療法或者藥物組合。“我們的目標是將癌癥從一種致命疾病轉(zhuǎn)變?yōu)橐环N慢性病，” Velculescu說?！爱斨委煵黄鹱饔脮r，可以換用其他的治療途徑?！?/div>

科學(xué)家們逐漸發(fā)現(xiàn)，腫瘤有著很高的異質(zhì)性，標準程序（tissue biopsy）根本不足以判斷癌癥的預(yù)后情況。而且活檢得到的是靜態(tài)信息，無法準確反映癌癥的演化。在這種情況下，ctDNA就成為了科學(xué)家們的新希望，它能為人們揭示更多的癌癥信息，甚至跟蹤癌癥的發(fā)展。

如果能夠得到充分利用，血液循環(huán)中的腫瘤DNA將為癌癥治療帶來一場變革。

理想與現(xiàn)實

潛力巨大，但目前ctDNA還無法成為臨床上的主要診療手段。這是因為，最靈敏的ctDNA檢測（例如BEAMing）需要事先知道想要檢測的突變，但獲得這樣的信息又相當麻煩。外顯子組測序不需要預(yù)先知道任何信息，但檢測罕見突變的需求深度測序，這樣做的成本非常高。

斯坦福大學(xué)的MaximilianDiehn決定將上述兩種方法的優(yōu)點結(jié)合起來。他的研究團隊發(fā)現(xiàn)，基因組有一小部分（僅0.004%）在肺癌中反復(fù)突變。在獲得患者血樣之后，對這一部分進行深度測序，能夠以低廉的成本檢測罕見突變。目前，該團隊正在嘗試將類似技術(shù)用于其他類型的癌癥，并在臨床試驗中加以驗證。

幾乎所有的活檢技術(shù)，都不能很好的檢測早期癌癥。ctDNA在一項研究中檢測出了所有II級以上的肺癌，但只檢測出了一半的I級腫瘤，這多半是因為晚期癌癥能釋放出更多的DNA。這個問題無意會限制ctDNA在癌癥篩查中的應(yīng)用。

在ctDNA走入臨床之前，還有一些其他的問題有待解決。例如，ctDNA是否能真實反映癌癥的特征？轉(zhuǎn)移瘤是否和原發(fā)瘤釋放同樣多的DNA？Diaz指出，人們需要在患者死后快速對所有腫瘤取樣，將其與患者生前的ctDNA進行比較?！斑@將是一項艱巨任務(wù)，”他說。

ctDNA提供的信息是否真的能夠挽救患者生命或者提高他們的生活質(zhì)量呢？“光監(jiān)控腫瘤是不夠的，”Johns Hopkins大學(xué)的腫瘤學(xué)家Luis Diaz說?！皩嶋H應(yīng)用才是我們面臨的真正挑戰(zhàn)?！?/div>

目前，癌癥的靶向性治療還遠遠跟不上科學(xué)家們的癌癥研究。如何將研究成果轉(zhuǎn)化為醫(yī)療進步，這也是ctDNA研究中最現(xiàn)實的一個問題。

ctDNA可能一時半會兒還無法決定癌癥的治療，不過它仍不失為一個寶貴的研究工具。越來越多的醫(yī)生正在把ctDNA采集列入自己的常規(guī)操作中。

小知識：CTC

1.循環(huán)腫瘤分子特征分析

英國癌癥中心發(fā)表在NatureReviews上的綜述，全面的介紹了CTC經(jīng)歷EMT機制入血到形成轉(zhuǎn)移灶的過程中CTC的分子特征的的變化。Matthew G. Krebs指出：CTC分析技術(shù)可以用于評估腫瘤異質(zhì)性和疾病進程，在治療過程中，身體中占支配地位的CTC是不斷變化的，伴隨治療耐藥的出現(xiàn)，耐藥性CTC逐漸在治療后增多。CTC的分析可以通過動態(tài)監(jiān)測腫瘤細胞的變化，實時、動態(tài)的反映患者的治療狀況及疾病進程，為目前的腫瘤治療監(jiān)測提供很好的補充。

2.CTC培養(yǎng)用于藥物敏感性試驗

哈佛醫(yī)學(xué)院的研究人員發(fā)表在science上發(fā)表的一項研究，研究通過體外培養(yǎng)循環(huán)腫瘤細胞，并將其用于基因測序和藥物敏感試驗。

哈佛醫(yī)學(xué)院的Daniel Haber從36個患者樣本中分離出了CTC細胞，并通過體外培養(yǎng)建立了細胞系。這些細胞系完整的保留了原始的細胞形態(tài)和特征，動物試驗顯示這5個CTC細胞系中有3個檢測到小鼠致瘤。

研究人員藥物敏感性試驗發(fā)現(xiàn)CTC藥物敏感性測量結(jié)果與臨床病史一致，包括紫杉醇和卡培他濱的敏感性、氟維司群和阿霉素的耐藥性。隨著CTC培養(yǎng)條件的優(yōu)化，這個策略可以幫助惡性腫瘤患者在整個疾病過程中接受最好的治療。

3.循環(huán)腫瘤胞團

由哈佛大學(xué)完成的一項關(guān)于循環(huán)腫瘤細胞團的研究發(fā)表在cell，該項研究中研究人員通過示蹤標記乳腺腫瘤的小鼠模型，發(fā)現(xiàn)CTC細胞團是由單克隆腫瘤細胞群形成而不是在血液循環(huán)中聚集形成。雖然血液中CTC細胞團相對單個CTC而言較為稀少，但是其形成轉(zhuǎn)移的潛能是單個CTC的20~50倍。該項研究說明循環(huán)腫瘤細胞團有更大的轉(zhuǎn)移潛能，是單個CTC轉(zhuǎn)移潛能的20~50倍。

4.CTC表型和核型分析的臨床意義

由北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院完成的一項關(guān)于循環(huán)腫瘤細胞表型和核型分析的研究發(fā)表在Oncotarget，研究人員通過陰性富集技術(shù)結(jié)熒光原位雜交技術(shù)檢測CTC，進一步分析胃癌CTC中人表皮生長因子受體（HER2）表達及8號染色體非整倍體。

該項研究結(jié)果顯示CTC水平的HER2檢測與靶向治療用藥相關(guān)，CTC核型分析表明8號染色體不同倍體對于紫杉醇、順鉑化療敏感或耐藥存在相關(guān)性。根據(jù)CTC 8號染色體核型或者HER2 表達可以監(jiān)測胃癌患者化療耐藥以及評估治療療效。