對大部分的同學來說，文章發(fā)在10分以上的雜志上基本屬于遙不可及的范疇了，特別是很多專業(yè)領(lǐng)域的頂級雜志也就5分左右。所以，在很多單位，文章發(fā)在了10分以上的雜志上，不說在單位里面橫著走，至少也是一段時間里的熱點話題了。但是，很多人一聽說文章發(fā)在Nature Communication（NC）上，似乎就釋然了：原來是NC，怪不得呢！灌水雜志，誰還不能發(fā)??！似乎，NC與PMOS一樣，是人人可以灌水和看輕的。

今天本宮就介紹一篇發(fā)表在NC上研究lncRNA促進肝纖維化的文章，大家可以看看這篇文章是不是如同某些同學說的那樣水？

這篇文章是7月26剛剛發(fā)表的，研究的是新lncRNA LFAR1通過激活TGFβ和Notch通路促進肝纖維化這一主題：

文章的通訊作者是天津醫(yī)科大學的洪偉教授，洪教授去年申請到的國自然面上項目就是研究lncRNA LFAR1在肝纖維化中作用的：

面上項目獲得資助后一年內(nèi)就發(fā)了NC，又有多少人能做到呢？

下面就讓我們假設(shè)我們是研究團隊，一步步地分析思路。

首先，我們明確研究方向，我們是肝膽科的大夫，肯定研究肝膽疾病，腫瘤做的人太多了，申請基金腫瘤口擠破頭，我們就選個肝纖維化吧（一、確定疾病類型）。最近聽了X濕兄的講座，覺得lncRNA相當靠譜（到底有多靠譜，單擊文末“閱讀原文”報名參加8月在北京舉辦的講座），就研究下lncRNA在肝纖維化中的作用機制吧（二、選定研究的基因類型）。我們的研究是以lncRNA為目標，那么lncRNA在肝纖維化發(fā)生的過程中產(chǎn)生了怎么變化？因何而變化？它的變化進而影響了什么？（三個問題）這些問題是我們接下來的研究需要解決的問題。當然了，上述問題可以部分解決，相應(yīng)的文章深度也會不同。

先說lncRNA在肝纖維化發(fā)生的過程中是如何變化的？

要研究這個，自然需要樣本，樣本哪里來？來咱這看肝纖維化的又不開刀啥的，沒有組織樣本，咱只能研究研究老鼠了（三、確定研究對象）。肝纖維化的動物模型也是比較成熟的，注射CCl4就好了，不算太復(fù)雜。如何確定其中的變化？有錢就自己做測序，省錢就挖挖別人的測序數(shù)據(jù)，再到自己構(gòu)建的動物模型中進行PCR驗證，結(jié)果同樣靠譜。

有了測序結(jié)果怎么篩潛在的值得研究的lncRNA？

1、表達量差異夠顯著；2、有潛在的生物學意義（與肝纖維化相關(guān)的mRNA做共表達分析初步驗證它們之間的表達相關(guān)性）。

到這里我們應(yīng)該已經(jīng)有兩部分實驗結(jié)果了：

1）動物模型成功構(gòu)建的結(jié)果（組織形態(tài)學和生化指標共同確定模型構(gòu)建成功）；

2）lncRNA的測序（或生信分析）的結(jié)果（熱圖表示差異基因以及后續(xù)的PCR驗證）。

上面的結(jié)果表明這10個lncRNA在肝纖維化的過程中都挺“特殊”的，究竟該翻哪個的牌子，本宮很是糾結(jié)。于是本宮在多個組織的纖維化和非纖維化的樣本中分別檢測上述lncRNA的表達量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)lncRNA-LFAR1在肝纖維化中具有非常顯著的組織特異性，表達量高且差異顯著。所以最后，我們翻了lncRNA-LFAR1的牌子。

lncRNA-LFAR1在不同組織中的表達量

有關(guān)表達量變化的研究似乎結(jié)束了，但是看了一下文獻中所描述的肝纖維化的發(fā)展過程，似乎哪里不對。

文獻中說肝纖維化是由肝細胞（HC）損傷和肝星形細胞的激活（HSC）共同作用的結(jié)果，這兩個細胞在肝纖維化的過程中似乎處于此消彼長的狀態(tài)，而我們做的測序是組織樣本的測序，并非單細胞測序，樣本中各種細胞類型都有，所以說同樣的分子在不同類型的細胞中的作用機制很有可能是不同的。

lncRNA-LFAR1在不同細胞中的表達量

此外，動物建模的過程是一個比較漫長的過程，基因的表達可能會隨時間變化，lncRNA-LFAR1在這一過程中是如何變化的，也是需要我們研究的。

α-SMA and lnc-LFAR1在HSC中不同時間的表達量

要研究lncRNA-LFAR1影響了什么，我們可以設(shè)計敲減和過表達實驗，以及挽救實驗，結(jié)合測序進行下游信號通路的檢測。不做測序的話可以直接通過文獻搜索，瞄準疾病直接相關(guān)的下游通路進行檢測。結(jié)合測序的我們叫有的放矢，不做測序的我們叫盲狙。我們通過生物信息學分析結(jié)合后續(xù)實驗驗證（PCR、WB）發(fā)現(xiàn)lncRNA-LFAR1影響了下游一大票與肝纖維化相關(guān)的基因以及激活Notch信號通路。

下游機制我們可以通過敲減過表達，檢測下游基因表達變化進行研究，而上游機制我們得首先通過查閱文章了解些背景資料，篩選潛在的目標。肝纖維化的過程中，TGFβ可以促進HSC的激活，而激活的HSC能夠進一步自分泌TGFβ維持活化過程。所以我們在設(shè)計挽救實驗的時候，將TGFβ處理作為另一個實驗條件，即lncRNA-LFAR1能夠挽救TGFβ誘導(dǎo)的HSC的活化。但是我們知道TGFβ不可能直接影響到lncRNA-LFAR1，中間應(yīng)該還有一個牽線的家伙（轉(zhuǎn)錄因子）。通過檢索肝纖維化過程中差異表達的轉(zhuǎn)錄因子，我們發(fā)現(xiàn)Smad2/3是潛在目標，接下來我們就驗證Smad2/3和lncRNA-LFAR1的關(guān)系，包括敲減過表達實驗，CHIP實驗還有熒光素酶實驗，參見尋找分子差異表達的上游機制（二）。

其實文章機制做到這里算是可以了，不過我們運氣不錯，偶然間又發(fā)現(xiàn)lncRNA-LFAR1還能上調(diào)Smad2/3，怎么調(diào)控的？ceRNA機制？RIP實驗結(jié)果表明lnc-LFAR1與AGO2沒有作用關(guān)系（lnc-LFAR1沒有調(diào)控相應(yīng)的miRNA），說明不是ceRNA機制；免疫沉淀反應(yīng)發(fā)現(xiàn)lnc-LFAR1與Smad2/3之間存在物理相互作用關(guān)系；ChIP實驗表明lnc-LFAR1能夠提高Smad2/3的啟動子活性，促進Smad2/3下游基因的轉(zhuǎn)錄。此外我們還通過生物信息學分析結(jié)合后續(xù)驗證發(fā)現(xiàn)也被lnc-LFAR1激活。

最后，我們把研究的關(guān)鍵分子：lncRNA LFAR1和TGFβ/Smad通路之間的調(diào)控關(guān)系在肝纖維化中的作用通過一張圖畫出來：

TGFβ促進Smad2/3磷酸化，Smad2/3活化促進lnc-LFAR1轉(zhuǎn)錄，lnc-LFAR1反過來能夠增強Smad2/3的啟動子活性形成正反饋回路，進而激活下游Notch通路，激活HSC，促進肝細胞凋亡，導(dǎo)致肝纖維化。

看到這里，還有同學覺得NC雜志水么？

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