過去 20 年來, 單分子成像與操縱領(lǐng)域的進(jìn)展迅速,孕育出了一門基于觀測(cè)單個(gè)分子來理解生物過程的新學(xué)科——單分子生物學(xué)。在全世界許多實(shí)驗(yàn)室的推動(dòng)下,這個(gè)嶄新的領(lǐng)域改變了我們對(duì)于許多生物學(xué)問題的思考與理解,并產(chǎn)生出很多新知識(shí)。

一個(gè)早期單分子生物學(xué)的例子是我們對(duì)膽固醇氧化酶催化的研究1。此酶含有的核黃素輔基在氧化態(tài)下是天然的熒光基團(tuán),而在還原態(tài)下則不發(fā)光。每一次熒光的“亮/滅”循環(huán)對(duì)應(yīng)一個(gè)酶分子催化狀態(tài)的翻轉(zhuǎn),從而使得對(duì)單個(gè)酶分子反應(yīng)的實(shí)時(shí)觀察成為可能。在單分子層面上,化學(xué)反應(yīng)是隨機(jī)發(fā)生的(即化學(xué)反應(yīng)發(fā)生所需的等待時(shí)間是隨機(jī)分布的),而不像在擁有大量分子系統(tǒng)中的反應(yīng)那樣有可被推測(cè)的結(jié)果。由于很多生物大分子(例如DNA)是以單分子或者少量幾個(gè)分子的形式存在于細(xì)胞之中,能對(duì)單分子化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行實(shí)時(shí)觀察就尤為重要。

單分子酶學(xué)也具有實(shí)際應(yīng)用意義。?例如,單分子測(cè)序儀通過監(jiān)測(cè)單個(gè)DNA聚合酶分子將有熒光標(biāo)記的核苷酸逐個(gè)合成到一個(gè)單鏈DNA 模板上的過程,以直接讀取DNA分子的序列 2。盡管單分子測(cè)序儀在成本、準(zhǔn)確性和通量方面還不能與基于大量分子的 DNA 測(cè)序儀相競(jìng)爭(zhēng),但它的一個(gè)獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)是能夠測(cè)很長(zhǎng)的 DNA 序列。2007 年以來基于大量分子(而不是單分子)的“ 新一代 ”DNA 測(cè)序儀的出現(xiàn),已開啟了激動(dòng)人心的個(gè)體化醫(yī)療的新紀(jì)元。

然而在基礎(chǔ)研究領(lǐng)域,單分子生物學(xué)不僅在體外而且在活細(xì)胞內(nèi)均增進(jìn)了我們對(duì)許多大分子系統(tǒng)工作機(jī)理的深入理解。一個(gè)基因在單個(gè)細(xì)胞中只有一個(gè)或者兩個(gè)拷貝,基因表達(dá)的過程和單個(gè)酶分子反應(yīng)一樣,也是隨機(jī)發(fā)生的。因此,單分子生物學(xué)與單細(xì)胞生物學(xué)是密切相關(guān)的。近年來,我們對(duì)單個(gè)活細(xì)胞中mRNA和蛋白質(zhì)分子逐個(gè)產(chǎn)生的隨機(jī) 過程進(jìn)行了詳細(xì)的研究,從而使得分子生物學(xué)的“中心法則”在單分子層面上得到了定量的描述 3。

DNA以單分子(單個(gè)染色體)的形式存在于每一個(gè)人體細(xì)胞中,所以基因組的變化也是隨機(jī)發(fā)生的。相應(yīng)的,人類生殖細(xì)胞分裂時(shí)發(fā)生的隨機(jī)重組使得每一個(gè)細(xì)胞都不相同,而癌細(xì)胞中劇烈的基因組變化也使得原發(fā)腫瘤中的細(xì)胞之間存在高度的異質(zhì)性。在一個(gè)細(xì)胞中最常見的基因組改變包括單核苷酸變異 [SNV,一種單堿基對(duì)的點(diǎn)突變;基因拷貝數(shù)變異(CNV)]。在人類整個(gè)基因組的六十億個(gè)堿基對(duì)中的一個(gè)特定的SNV就可能導(dǎo)致遺傳性疾病;而 CNV 通常發(fā)生在生殖細(xì)胞分裂時(shí)的染色體分離過程中以及腫瘤細(xì)胞內(nèi)基因組的重排錯(cuò)誤(包括插入、缺失、染色體倒位和易位)。由于SNV和CNV在不同細(xì)胞中的發(fā)生是隨機(jī)的、不同步的,因此每個(gè)細(xì)胞都擁有不同的基因組,這使得單細(xì)胞測(cè)序成為必需。而直到最近,由于單細(xì)胞基因組學(xué)的發(fā)展,這種必需才變得可行4。

給單個(gè)人類細(xì)胞做全基因組測(cè)序需要對(duì)其進(jìn)行全基因組擴(kuò)增(WGA)。新近發(fā)展的一種 WGA 方法——多重退火循環(huán)擴(kuò)增法(MALBAC)5,可以比此前廣泛應(yīng)用的MDA方法更準(zhǔn)確地檢測(cè)SNV和CNV。MALBAC 可以在人體細(xì)胞中數(shù)字化地計(jì)數(shù)一個(gè)基因的拷貝數(shù),并且能夠沒有假陽(yáng)性地檢測(cè)單個(gè)SNV(雖然可能會(huì)有一定的假陰性)5。

最近,我們把 MALBAC 用于協(xié)助人工輔助生殖和癌癥的研究,兩者皆對(duì)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)有著重要意義。在人工輔助生殖領(lǐng)域,為了避免染色體異常和單基因疾病的遺傳,MALBAC 已經(jīng)被應(yīng)用于胚胎植入前基因組篩查(PGS)和胚胎植入前遺傳學(xué)診斷(PGD)6。染色體異常(即染色體層面上的拷貝數(shù)變異)是流產(chǎn)及許多遺傳性疾病(如唐氏綜合征)的主要致因。同樣,約7000種單基因遺傳疾病會(huì)嚴(yán)重影響人類健康,并對(duì)病人家庭和社會(huì)醫(yī)療體系產(chǎn)生沉重負(fù)擔(dān)。

雖然PCR、熒光原位雜交(FISH)和 DNA微陣列芯片等方法都已經(jīng)被用于PGD 和PGS,MALBAC能夠提供更高的精確度,并可以同時(shí)避免染色體異常和危險(xiǎn)點(diǎn)突變的發(fā)生。2014年,隨著兩個(gè)“MALBAC 嬰兒”的出生,我們成功地利用了MALBAC來篩選健康胚胎,使嬰兒基因組中避免帶有父母中一方所攜帶的遺傳疾病基因7。這為患有遺傳性疾病(或 攜帶遺傳疾病基因)的夫妻帶來了福音, 他們現(xiàn)在可以以很高的成功率避免將那些具有嚴(yán)重危險(xiǎn)的突變傳給下一代。

在這兩個(gè)病例中, MALBAC 極低的假陽(yáng)性和假陰性率完美地滿足了父母希望后代不再攜帶嚴(yán)重的雜合致病突變的要求。類似的方法可以減少某些疾病(如乳腺癌)在下一代中的遺傳風(fēng)險(xiǎn)。選擇一個(gè)風(fēng)險(xiǎn)較低的等位基因(如特定的 BRCA 基因序列)在技術(shù)上是可行的,但在倫理層面上還需進(jìn)一步討論。

眾所周知,癌癥是一種基因組疾病8。循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)在進(jìn)入外周血液循環(huán)后可能介導(dǎo)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移,并導(dǎo)致 90%與癌癥相關(guān)的死亡。MALBAC方法也被用于單個(gè)CTC 細(xì)胞測(cè)序。與癌癥高度異質(zhì)性的點(diǎn)突變不同,通過分析肺癌患者的單個(gè) CTC 基因組,我們發(fā)現(xiàn) CTC的CNV模式在一個(gè)病人體內(nèi)以及在患同一種癌癥的不同病人中是相似的, 但在不同的癌癥類型中是截然不同的。此外,這些CTC中重復(fù)出現(xiàn)的CNV模式 與患者的轉(zhuǎn)移灶腫瘤細(xì)胞 CNV 模式也是一致的9。顯然, 染色體特定區(qū)域拷貝數(shù)的增減模式被腫瘤轉(zhuǎn)移所選擇。循環(huán)腫瘤細(xì)胞CNV 模式與癌癥類型有關(guān)這一發(fā)現(xiàn)為我們提供了基于CNV模式進(jìn)行無(wú)創(chuàng)癌癥診斷的可能。因此,單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增方法的進(jìn)一步發(fā)展將使我們不僅能夠更好地了解腫瘤異質(zhì)性和癌癥轉(zhuǎn)移的機(jī)制10,而且有望實(shí)現(xiàn)對(duì)癌癥的個(gè)體化診療。

總結(jié)

DNA以單分子的形式存在于每個(gè)細(xì)胞中,因此基因表達(dá)和基因組的變化是隨機(jī)發(fā)生的,這也使得在單細(xì)胞和單分子水平上的測(cè)量成為必需。單細(xì)胞基因組學(xué)發(fā)端于單分子技術(shù)與基因組學(xué)的交匯之處。在單細(xì)胞中進(jìn)行精確基因拷貝數(shù)的計(jì)數(shù)以及基因點(diǎn)突變的檢測(cè)現(xiàn)在不僅已成為可能,而且正在成為日益重要的技術(shù)。這些手段使得我們能夠在單個(gè)分子的層面上檢測(cè)、理解并改善生命過程,也為我們提供了“精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)”的生動(dòng)案例。

致謝:我很感謝我目前和過去研究組所有成員以及合作者的貢獻(xiàn),特別是喬杰、湯富酬、陸思嘉博士在人工輔助生殖項(xiàng)目上的貢獻(xiàn),王潔、白凡、張寧博士在循環(huán)腫瘤細(xì)胞項(xiàng)目上的貢獻(xiàn)。（來源：北京大學(xué)生物動(dòng)態(tài)光學(xué)成像中心）JAMA綜述原文（英文）下載