我做 western 的時候，發(fā)現(xiàn)目前的資料都很老，網(wǎng)上的資料也大多互相傳抄，說法各異，于是綜合了目前網(wǎng)上所能找到的資料和個人實際經(jīng)驗，編輯了這份 western blot 操作步驟，內(nèi)容包括主要操作步驟和所需要注意的有用的細節(jié)，并附上參考文獻。

我按下文的步驟操作已經(jīng)做出來了穩(wěn)定可重復的、背景干凈的 western 條帶了，所以相信你也行。為了節(jié)省時間，我總結(jié)了一下 western blot Quick Guide和一天做出 western 的具體時間規(guī)劃，附在文末，要在下一次展示。

蛋白質(zhì)印跡的發(fā)明者是斯坦福大學 George Stark。Neal Burnette 于 1981 年所著的 Analytical Biochemistry 中首次被稱為 Western Blot。最開始做印跡的是一個叫 Southern 的科學家，但印跡的對象是 DNA 鏈，他把這種技術(shù)稱為  Southern blot，后來出現(xiàn)了兩個過程相似，但是對象不同的印跡方法，一個針對RNA，一個對蛋白質(zhì)，人們分別把這兩種技術(shù)的稱為 Northern 和 Western，與這兩個技術(shù)的發(fā)明人沒有關(guān)系了。

由于這一步方法各異，具體步驟請參考試劑盒的說明書即可。蛋白質(zhì)的樣品制備是 Western Blotting 的第一步，樣品制備是關(guān)鍵步驟，要求盡可能的獲得所有蛋白質(zhì)，應(yīng)注意以下問題：

1. 清洗玻璃板
   

   
   

   蘸點洗潔精輕輕擦洗。兩面都擦洗過后用自來水沖，再用蒸餾水沖洗干凈后立在筐里晾干。若不繼續(xù)使用，需用無水乙醇擦拭后晾干再妥善收起來，玻璃板之間墊玻璃紙隔開。梳子應(yīng)用水洗干凈，臨用前用無水乙醇擦拭晾干。

   
   

2. 灌膠與上樣

   
   

   ① 玻璃板對齊后放入夾中卡緊。然后垂直卡在架子上準備灌膠（操作前先往玻璃板間灌水，檢查是否漏）。

   
   

   ② 按配膠試劑盒說明書選擇合適的分離膠濃度配置，最后加入 TEMED，之后搖勻即可灌膠。配制凝膠時要充分混勻，此外應(yīng)保證試劑的新鮮，特別是過硫酸銨。

   
   

   灌膠時掌握好速度，避免氣泡產(chǎn)生（注意濃度越小的膠含水越多，凝固后膠體積縮小越多）。然后膠上加一層水，液封后的膠凝的更快（灌膠時開始可快一些，膠面快到所需高度時要放慢速度。操作時膠一定要沿玻璃板流下，這樣膠中才不會有氣泡。加水液封時要很慢，否則膠會被沖變形）。

   
   

   未聚合的丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性，操作時應(yīng)該戴手套防護。梳子插入濃縮膠時，應(yīng)確保沒有氣泡。注意給積層膠留出足夠的空間（分子克隆推薦長度為插入的梳齒長再加 1 cm）。

   
   

   ③ 當水和膠之間有一條折射線時，說明膠已凝了。再等幾分鐘覺得差不多的時候就可倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。聚合時間由 AP 以及 TEMED 決定，通常在 30 min 左右，AP 不新鮮會導致聚合變慢，氣溫較低時膠是會凝得慢一些，必要時可適當增加 AP 以及 TEMED 的量，但通常不會超過 1 h，若超過 1 h 甚至更長仍未聚合，應(yīng)檢查配制的操作有無錯誤。

   
   

   由于 TEMED 催化 APS 釋放相關(guān)化學基團，再由 APS 釋放的基團催化 Acr/Bis 聚合，所以如果 APS 不新鮮的話加再多的 TEMED 效果也不佳，這就是為什么推薦 APS 每周新鮮配置的原因。

   
   

   ④ 按說明書配積層膠，加入 TEMED 后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。灌膠時也要使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣泡產(chǎn)生。插梳子時要使梳子保持水平。

   
   

   由于膠凝固時體積會收縮減小，從而使加樣孔的上樣體積減小，所以在濃縮膠凝固前最好在兩邊補膠至剛剛冒頂。待到濃縮膠凝固后，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出。

   
   

   ⑤ 趁積層膠聚合的這段時間，取適當體積樣本混合 1X SDS loading buffer（最好事前分裝好，每次從冰箱里取一管即可），95~100° 加熱 5 min，若有沉淀可用稍低溫度，比如 45~55° 加熱 1 h 達到變性的目的。我一般習慣分裝 20 ul 到 PCR 管里，先和 loading buffer 混合好，臨用前用 PCR 儀加熱 95 °C 5 min，效果不錯。

   
   

   ⑥ 膠做好后連同玻璃板一起安裝到電泳槽上，加入電泳緩沖液后開始準備上樣（我們使用的是大連競邁科技公司的 MV-III 型小型單垂直板電泳槽，電泳液至少要漫過內(nèi)測的小玻璃板，電泳槽下面不用倒太多電泳液）。加樣前可用 5 ml 注射器或加樣器先沖洗一下加樣孔。用微量加樣器貼壁吸取樣品，將樣品吸出不要吸進氣泡。將加樣器針頭插至加樣孔中緩慢加入樣品（加樣太快可使樣品沖出加樣孔，若有氣泡也可能使樣品溢出。加入下一個樣品時，進樣器需在外槽電泳緩沖液中洗滌 3 次，以免交叉污染。

   
   

   目前我們做的 mini 膠上有 10 個上樣孔，一般在第一個孔加入 marker（我用的是 Fermentas 預染 marker），其余 9 個孔加入樣品，也可在頭尾孔內(nèi)加入 marker，中間 8 個孔加樣品。加樣前樣品應(yīng)先離心，尤其是長時間放置的樣品。在未加樣的孔中應(yīng)加入等量的樣品緩沖液。上樣時，小心不要使樣品溢出而污染相臨加樣孔。也可使用 10 ul 的槍頭就行，比用微量加樣器快很多，用槍頭時注意不要插得太深，容易把玻璃板撐開，樣品就落到膠和玻璃板之間的空隙了。

   
   

3. 電泳

   
   

   電泳槽內(nèi)加入電泳緩沖液沖洗清除黏附在凝膠底部的氣和未聚合的丙烯酰胺，網(wǎng)上有資料建議低電壓短時間的預電泳，清除凝膠內(nèi)的雜質(zhì)，疏通凝膠孔徑以保證電泳過程中電泳的暢通，但是在《分子克隆》上卻反對這種做法，理由是會破壞緩沖系統(tǒng) pH 的不連續(xù)性。

   
   

   請各位按照實際經(jīng)驗來做即可。電泳時間和電壓說法各異。按照各實驗室的慣例或者電泳槽的使用說明來操作。

   
   

   電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳，進行轉(zhuǎn)膜。為減少蛋白質(zhì)條帶的擴散，上樣后應(yīng)盡快進行電泳，電泳結(jié)束后也應(yīng)直接或者轉(zhuǎn)印。

今天就講到這兒，欲知后事如何，且聽下回分解。