結直腸癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，在美國占據癌性死亡率的第2位。近年來研究發(fā)現有絲分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)信號通路在結直腸癌發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用，而Braf[1] 基因編碼的絲/蘇氨酸激酶正是該通路重要的轉導因子，參與調控細胞內多種生物學事件，當通路被異常激活時，腫瘤即可發(fā)生[1]。本文將對Braf基因突變在結直腸癌中的分子生物學特征、臨床病理特點及目前治療的困難及展望做相應闡述。

　　Raf是第一個發(fā)現的，也是研究得最為透徹的Ras通路效應蛋白。激活的Ras蛋白與Raf蛋白(絲/蘇氨酸蛋白激酶)結合，從而激活Raf蛋白，后者又磷酸化MEK1/MEK2上的調節(jié)性絲氨酸，從而激活MEKs;激活后的MEKs能高度選擇性地激活ERK，最終導致細胞增殖、血管生成、轉移、影響細胞凋亡。Raf激酶是一組蛋白，家族成員包括Araf，Braf，Craf [1]。實體瘤中，惡性黑色素瘤中的Braf突變幾率是最高的，有40-60%[2,3]，在乳頭狀甲狀腺癌中這一幾率為36-53%[4]，但是在結直腸中只有7-10%[5]。Braf基因的突變位點主要位于基因的第15外顯子，其中約92 %位于第1799位核苷酸上(T突變?yōu)锳)，導致其編碼的谷氨酸被纈氨酸取代(V600E)。這一突變導致了MARK信號通路的持續(xù)激活。Ras和Braf的突變是互斥的[6]。

　　目前的研究認為，大約有85%的結直腸癌中存在染色體不穩(wěn)定(chomosomal instability，CIN)，從而導致Kraf、Raf等癌基因激活和APC、P53 等抑癌基因失活，這種異常表達不斷累積促使腸上皮細胞完成經典的“腺瘤—腺癌”這一成瘤過程。但近年來研究發(fā)現，除了這條通路，還有10%的結直腸癌是通過鋸齒狀息肉途徑發(fā)生癌變的[7]。Braf突變與這一成瘤過程密切相關。另外，與鋸齒狀息肉途徑癌變途徑呈明顯相關性的分子生物學改變還包括CpG島甲基化表型(CpGisland methylator phenotypes，CIMP)，和微衛(wèi)星不穩(wěn)定(microsatelliteinstability，MSI)[7]。

　　大約90%的遺傳性非息肉病性大腸癌(hereditarynonpolyposis colorectal cancer，HNPCC)和15%散發(fā)性結直腸癌分子表型均為MSI，但兩者MSI 發(fā)生機制不盡相同。在HNPCC 中是主要是由于錯配修復(mismatch repair，MMR)基因胚系突變引起的，其中MSH2 與MLH1兩個基因突變占所有MMR基因突變的90%。而散發(fā)性結直腸癌中，主要是由于MLH1基因啟動子CIMP高表達致使表基因沉默引起MSI，該途徑受 MAPK/ERK信通路調控，Braf基因是其重要的調控因子[9]。因此在散發(fā)的MSI結直腸癌中，約有40至60%出現Braf突變，然而在微衛(wèi)星穩(wěn)定(microsatellite stability，MSS)的結直腸癌中這一幾率只有5-10%。而且，Braf突變的腫瘤幾乎都不是胚系突變。

　　既往的研究表明Braf突變與年齡、性別、原發(fā)部位、病理類型、轉移模式和預后均明顯相關。

　　年齡越大，Braf突變的概率越高,在<55歲的msi人群中，braf突變的幾率是7%，但在55-79歲的人群中，這一幾率為61%[11]。女性患者中，braf突變的幾率也是升高的。有人認為，是因為braf突變與cimp高表達有關，而cimp高表達是與女性有關的[12]。此外，有多項研究表明，braf突變與右半結腸癌相關[12,13,14]，值得注意的是, yamauchi="" 等人[15]發(fā)現發(fā)病部位與braf突變幾率的線性關系。隨著發(fā)病部位從升結腸至直腸，braf突變幾率從近="" 40%="" 降至2.3%="">< 0.000)="">

　　在分化差及粘液腺癌中，Braf突變也是較常見的。Braf突變的腫瘤有40-50%是分化差的，只有6-16%是高到中分化的。粘液腺癌有22-67%的比例含有Braf突變，在非粘液腺中這一比例是6-21%[17,18,19]。

　　和其他腫瘤一樣，某些致癌基因可能會導致特定的表型行為。澳大利亞及美國的學者對524例轉移性的結直腸癌患者進行研究，第一次發(fā)現Braf突變的腫瘤中腹膜轉移及遠處淋巴結轉移的幾率都更高。這也許能部分解釋為什么Braf突變的腫瘤預后差[20]。

　　Braf V600E突變在轉移性結直腸癌中被明確證明與較差預后相關。一項III期臨床研究，對比了化療+貝伐珠單抗及化療+貝伐珠單抗+西妥昔單抗在轉移性結直腸癌中一線治療的療效，亞組分析發(fā)現Braf突變型的患者在這兩組中療效都不好，中位PFS及OS都遠低于野生型患者[21]。另一項回顧性、多變量分析研究了轉移性結直腸癌患者接受5-FU為基礎的化療后的疾病進程，顯示Braf突變是生存的獨立不良預后因素，PFS也遠短于野生型的患者[22]。

　　上文提過Braf突變與MSI是相關的。有研究者對澳大利亞皇家墨爾本醫(yī)院和美國德州大學MD安德森癌癥中心這兩家醫(yī)療機構的55位MSI-H(高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定)表型的轉移性結直腸癌患者進行了回顧性研究[23]。存在BrafV600E突變的13例患者的中位總生存期較短(BrafV600E突變的患者10.1個月，其他患者17.3個月，P=0.03)。而且MSI-H表型的轉移性結直腸癌的患者并沒有提高預后，雖然MSI-H在早期結直腸癌患者中預示良好預后。但是一項2013年的針對1253例結直腸癌患者研究顯示[24]，綜合MSI及Braf突變兩個因素，結直腸癌特異性5年生存率在MSS/BRAF 突變組中是46%，在 MSS/Braf野生組中是65% ,MSI-H/Braf突變組中是73%，MSI-H/Braf野生組中是79% 。MSI及Braf突變在生存模型中沒有交互作用。MSI-H提示預后良好，Braf突變提示預后差 [25]。

　　有趣的是，近期另一項研究顯示[26]，Braf密碼子594或者596的突變的結直腸癌雖然只占結直腸癌中不到1%的比例，但與Braf V600E突變的結直腸癌在分子特征、病理特征、臨床轉歸上都很不同。上文提及V600E突變的患者更常見于右半結腸、病理常為粘液性癌、常發(fā)生腹膜轉移、預后較差。此文作者在單變量及多變量分析中都發(fā)現，與V600E突變的結直腸癌相比，密碼子594或者596突變的患者常見于直腸，病理常為非粘液腺癌，往往發(fā)生非腹膜轉移，有更長的OS (62.0個月vs.12.6個月，P=0.002)。但因樣本比較少，還需要更大宗的研究來驗證。這也提示我們去應進一步細化Braf突變的亞型。

　　CRYSTAL研究[27]的結果首次證實了在化療(FOLFIRI)基礎上加用西妥昔單抗能給Kras野生型轉移性CRC患者帶來明確的OS獲益，對Kras野生型患者不同Braf基因狀態(tài)的分析顯示，Braf基因突變的患者預后更差，FOLFIRI對照組中，Braf野生型患者中位OS為21.3個月，突變型患者只有10.3個月，加用西妥昔單抗后，Braf突變型患者的中位OS能提高至14.1個月。由于樣本量較少，與單獨FOLFIRI化療相比，尚未顯示出顯著差異，這也提示Braf基因的狀態(tài)只是預后因素，而非西妥昔單抗療效的臨床預測因素。

　　OPUS研究[28]納入的患者中，Kras基因狀態(tài)確認比例達到了93%(315/337例)，其中Kras野生型患者有179例(57%)，其中11例(6%)為Braf基因突變。對Braf基因突變患者療效的分析顯示，不管是單純FOLFOX4方案化療還是FOLFOX4聯合西妥昔單抗，Braf突變都與較差的預后有關，但是西妥昔單抗聯合FOLFOX4方案治療的患者，與單純接受FOLFOX4化療相比，PFS有延長的趨勢(7.1個月vs.1.7個月)，在OS方面甚至達到顯著差異(20.7個月vs.4.4個月)。雖然在OPUS研究中Braf基因突變患者樣本量較少，但還是可以顯現出Braf基因突變患者可從西妥昔單抗治療中獲益的趨勢。

　　2014年ESMO轉移性結直腸癌指南認為Braf突變在預測EGFR單抗療效方面存在有爭議，而當前更多的研究都傾向Braf突變的患者不管是使用EGFR單抗還是EGFR單抗聯合化療都不能獲益[29]。同樣的，2015年NCCN結腸癌指南也措辭非常謹慎的提出了當前沒有足夠的數據支持Braf基因狀態(tài)可以指導一線治療中EGFR單抗的使用[30]。

　　既往的一系列研究都得出常規(guī)治療對Braf突變的結直腸癌患者來說收效甚微，整體來看，OS一般波動在9到14個月之間，而PFS只有4-6個月[22,27,28]。找出合適方案，盡可能提高Braf突變結直腸癌患者的預后，仍是一道難題。

　　2010年一項GONO研究組的一項II期臨床研究探索了FOLFOXIRI+貝伐珠單抗在晚期結直腸中的安全性及有效性，亞組分析顯示Braf突變的患者中位PFS達到了12.8個月，中位OS達到了23.8個月[31]。隨后的TRIBE 研究證實了貝伐珠單抗聯合FOLFOXIRI方案較聯合FOLFIRI方案顯著增加PFS和應答率[32]。尤其是 RAS 突變、Braf突變和全野生型的轉移性結直腸癌患者進的亞組分析顯示，FOLFOXIRI+貝伐珠單抗組Braf 突變型的中位OS達到19.1個月,中位PFS達7.5個月，而FOLFIRI+貝伐珠單抗組中位OS只有10.8個月,中位PFS只有5.5個月[33]。雖然對常規(guī)化療不敏感，但這些數據均支持Braf突變型可能從FOLFOXIRI+貝伐珠單抗的強烈治療中獲益。Loupakis F[34]等人進行了一項II期臨床試驗，214位患者篩查Braf狀態(tài)，7%的突變比例，共15位患者接受了一線FOLFOXIRI+貝伐珠單抗的治療，6個月無進展患者比例達到了73%，中位PFS及OS達到了9.2個月和24.1個月，RR率及疾病控制率分別達到了72%及88%。雖然該試驗缺乏隨機性，但對于伴有Braf突變的轉移性結直腸癌患者而言，在FOLFOXIRI化療方案中添加貝伐珠單抗或是一種有效的一線治療方案選擇。

　　那么這么強力的方案，其安全性如何呢。以上臨床試驗的數據顯示，不良反應方面，和以前報道的化療及貝伐珠單抗的不良反應是一致的，主要包括中性粒細胞減少, 腹瀉,和高血壓。除了中性粒細胞4度下降，其他4 度不良反應的比例很低，而且沒有報道與治療相關的死亡[31,34]。TRIBE研究[36]還發(fā)現雖然3到4級神經毒性、胃炎、腹瀉、中性粒細胞下降在貝伐珠單抗聯合FOLFOXIRI組中比例較高，但是SAE、與治療相關的死亡率及粒細胞缺乏發(fā)熱的比例兩組并無區(qū)別。故FOLFOXIRI聯合貝伐珠單抗對于一般情況好的Braf突變的患者是可以考慮積極嘗試的。

　　Braf V600E小分子抑制劑vemurafenib(RG7204; PLX4032; RO5185426)對黑色素瘤有良好的療效，一項對比Braf抑制劑(Vemurafenib)及氮烯咪胺(達卡巴嗪, Dacarbazine)的三期臨床試驗顯示，在BrafV600E突變的人群中，Braf抑制劑組的最佳總反應率是48%，高于氮烯咪胺組的5%[35]。但遺憾的是，Braf抑制劑對于同樣有Braf突變的結直腸癌患者效果不佳，一項針對21例Braf突變結直腸癌患者的研究發(fā)現，21例患者應用Braf抑制劑，只有1例部分有效 (5%) 及 4例好轉[36]。一些學者對耐藥機制進行了研究。Prahallad等[37]發(fā)現Braf抑制劑治療一些Braf突變的結直腸癌細胞系導致了反饋性EGFR的激活，Corcoran等[38]發(fā)現在Braf抑制劑阻斷Braf后，EGFR能介導Craf和MARK下游通路的快速再激活從而導致耐藥，這也給聯合多靶點抑制的治療策略提供理論依據。

　　根據一項提交在2015年ASCO年會上的I/II期研究結果顯示[39]，Braf抑制劑(dabrafenib)、Mek抑制劑(trametinib)和EGFR單抗(帕尼單抗)三藥聯合治療既往治療過的BrafV600E突變的轉移性結直腸癌(mCRC)，客觀有效率可達26%，中位PFS為4.1個月。該研究的理論基礎是在Braf抑制劑和Mek抑制劑基礎上加入EGFR單抗，將對MARK信號通路造成更有效的封鎖。另一項2015年ASCO會議上發(fā)表的III期COMBI-D試驗顯示，Braf抑制劑聯合Mek抑制劑與Braf抑制劑單藥相比，在總生存上更有優(yōu)勢[40]。該研究的最終分析結果發(fā)現，聯合用藥組的中位OS為25.1個月，而Braf抑制劑單藥組為18.7個月。綜上，單獨抑制Braf V600E這個靶點在結直腸癌中因繼發(fā)耐藥的發(fā)生而收效甚微，但是聯合多個藥物阻斷MARK通路上的不同靶點可能會有良好的療效。

　　如前文所述，MMR缺陷(dMMR)發(fā)生在15~20%的偶發(fā)性(非遺傳性)結直腸癌和幾乎所有與Lynch綜合征相關的結直腸癌(占所有結直腸癌5%)中，其表型均為MSI。錯配修復基因缺陷(dMMR)的腫瘤與同類型不含這種修復缺陷的腫瘤相比較，會含有更多個突變?；谶@項理論，研究者推測錯配修復缺陷腫瘤會特別容易受到免疫檢查點阻斷。2015年ASCO年會上，Dung T. Le[41]發(fā)表了一項關于錯配修復缺陷腫瘤預測抗PD-1應答的重磅研究。在結直腸癌患者中，PD-1抑制劑(pembrolizumab)治療后，62%的dMMR腫瘤患者呈現出腫瘤縮小，而那些無dMMR的患者沒有檢測到響應。這項研究橋接了免疫治療和基因組學，雖然Braf突變相關的MSI不是由錯配修復基因突變所致，但是我們似乎看到了Braf突變人群未來進行免疫治療的曙光。

　　Braf突變是結直腸癌中發(fā)生的重要基因改變之一，在高齡、女性、右半結腸、粘液腺癌中常見，且容易出現腹膜及遠處淋巴結轉移，并意味著不良預后。FIRE-3研究[42]及CALGB/SWOG 80405研究[43]中RAS野生型患者的OS可達30個月以上，但上文提過，在Braf突變的人群中，OS僅在10個月左右。單純化療對這類人群并不敏感，是否使用EGFR單抗還存在爭議。但是在合適的人群中使用強力的系統治療(FOLFOXIRI+貝伐珠單抗)似乎是安全有效的。未來我們還可考慮多靶點阻斷MARK通路，而且免疫治療似乎也出現了曙光。

　　近來，結直腸癌分型聯盟(CRCSC)應用大數據建立亞型聯合檢測，將結直腸癌的分子分型擴展為CMS 1～4 型和未定義型5 類，每種亞型具有不同的分子學特征和通路特性，并表現出不同的臨床特征[44]。這4種亞型在不同部位結直腸癌中所占比例各有不同，例如CMS1更多見于右結腸癌、女性、診斷時年齡更大、伴有BRAF突變、MSI、免疫通路活化/ 表達，這些病人往往復發(fā)后生存期短。故將來分子特征對于患者的人群的劃分更加重要，根據分類予以不同的干預措施，最終實現個體化、精準化治療。